實驗四-逆轉(zhuǎn)錄

實驗四逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)【實驗?zāi)康摹苛私庥媚孓D(zhuǎn)錄PCR法獲取目的基因的原理。2．學(xué)習(xí)和掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)和方法。【實驗原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)〔PCR〕過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個循環(huán)來擴(kuò)增DNA序列。因為上一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板，是一個指數(shù)增長的過程，使其成為檢測核酸和克隆基因的一種非常靈敏的技術(shù)。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板DNA擴(kuò)增達(dá)106倍。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA〔complementDNA〕合成〔即RNA的反轉(zhuǎn)錄〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR結(jié)合在一起的技術(shù)，提供了一種基因表達(dá)檢測、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子，只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達(dá)和功能研究，因此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、表達(dá)差異，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的基本原理〔圖，。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從RNA合成cDNA，即總RNA中的mRNA在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板mRNA，稱之為互補(bǔ)DNA(cDNA,；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸(dNTP,為材料，在引物的引導(dǎo)下復(fù)制出大量的cDNA或目的片段。在RT時，有3種引物可選擇〔表4.1)。用1〕和2〕方法，理論上是擴(kuò)增的所有的cDNA，還要用此產(chǎn)物做PCR的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用3〕方法，先要去 ://查它的序列，并用oligo等軟件設(shè)計引物。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測或克隆多個基因的mRNA時比較有用。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最正確條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。而一步法RT-PCR具有其它優(yōu)點〔表,cDNA合成和擴(kuò)增反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，不需要打開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，最低可以到達(dá)總RNA，因為整個cDNA樣品都被擴(kuò)增。對于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特異性引物(GSP)起始cDNA的合成。由圖不難看出，隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的，部分長度的CDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經(jīng)驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20口丨反應(yīng)體系。因為使用隨機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%,所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20口l反應(yīng)體系使用口goligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。基因特異性引物(GSP,對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)粒或噬菌體中，為此，首先必需有適當(dāng)?shù)慕宇^(Linker)，接頭可以是在PCR引物上增加限制性內(nèi)切酶識別位點片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入相應(yīng)的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。本實驗是要從小鼠肝臟組織中獲取Fas配體基因，F(xiàn)as配體(FasL)是一分子量約為40u的II型跨膜糖蛋白，屬TNF家族成員?；罨腡細(xì)胞可表達(dá)Fas和FasL，并通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在部分癌細(xì)胞中FasL表達(dá)增強(qiáng)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長cDNA并構(gòu)建其表達(dá)載體，可以為進(jìn)一步研究FasL的功能提供條件。在上下游引物的5'端分別加上了限制酶切位點及其保護(hù)堿基〔即HindIII和BamHI〕，以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達(dá)載體pGFPUv上〔附錄圖〕。為了便于后續(xù)實驗可以用金屬螯和層析的方法別離和純化目的蛋白，我們改造了pGFPUv,在其上加了6XHis標(biāo)簽。表4.1RT-PCR引物選擇的履則隨機(jī)引物.(RandomOmers；)'適用于長的或具有發(fā)卡箔枸的恥IS適用于rKMA.mlOlA.tKNA等所育RNA的反輕錄反應(yīng)。主要用于阜一模板的比1中CR反應(yīng)只Oligodi(OligodTAdaptorPrim-er)適用于具有Polka屋巴的RNA＜由于Oligodet要結(jié)合到Polka屋巴上汀斤反對KNA樣品的質(zhì)量宴求較高，即使有少量隔解也會:使全長tDNA合成量丈犬減歲基因特異性引物(Gen七SpeciHcPrimer^GSP)與模板序列互補(bǔ)的引物』適用于目的序列已知的情況。表4.2 —步法和兩步法RT-PCR的比較兩步法一步法起始第YScDY恵合成使用：起始第F合成使用：0庵電耳隨機(jī)六漿依GEP弓i物GSP刖物優(yōu)點優(yōu)點艮活 j方便 1引物選擇 |擴(kuò)增酶同逆轉(zhuǎn)錄醃預(yù)先混合"1擴(kuò)增酶的選擇 |轉(zhuǎn)管步驟少,減少污染可能性困難RT-PCR的優(yōu)化能力 ]盒靈敏度 ~1kiSH選用不同特性的dnaR合酶和改變反應(yīng)條件，”高擴(kuò)增的特異性和忠實性 j適用于大量樣品井析適用于在單個樣品中檢測或克隆務(wù)個基因的mR州A適用于定量PCR

PCR擴(kuò)增?4.1RT-PCK1?團(tuán)【試劑與器材】〔一〕試劑1.總RNA〔或mRNA〕酶抑制蛋白〔RNaseInhibitor〕：40U/mLdNTP混合物(各10mM)4.oligo(dT)12-18：2.5mol/L5.10*逆轉(zhuǎn)錄合成緩沖液〔10RTbuffer〕:250mmol/LTris-HCl(pH8.3),375mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2逆轉(zhuǎn)錄酶5u/L基因特異性5'和3'引物各20mol/LTapDNA聚合酶5u/L9.10*PCR緩沖液：500mmol/LKCl,100mmol/LTris?Cl,在25°C下,,1.0%TritonX-100,15mmol/LMgCl2?！捕称鞑?：PCR儀,2：PCR管,3：微量移液器【操作方法】〔一：逆轉(zhuǎn)錄：1）建立RT反應(yīng)體系:總RNA或?qū)φ誖NA0-5-1昭EP擊昆合物2Loligo(dT)12-181HL10xRI緩沖液訶AMV逆鈣錄酶1HLInhibitor0.5\1LDE氏水扣至20pLTotalvolume 20|dL2）渦旋混勻，42°C反應(yīng)1小時，95°C加熱5分鐘，然后置于冰上。〔二〕PCR擴(kuò)增：1）建立PCR反應(yīng)體系：上步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA10L基因特異性寧和歹引物dNIP規(guī)臺物1Ll&xPCX緩沖液5遼T叫DMA聚合酶0.5吐DEPC水初至刃吐Totalvolume 50pl2）將上述反應(yīng)體系渦旋混勻，按以下程序運(yùn)行循環(huán):stepl變性5minst-ep21minstep35北賓性90secst-cp47比延伸90secstepS疋遼溫育10minstepfi沱保存lhr-過夜step2-4運(yùn)行30個循環(huán)，其中復(fù)性溫度主要依據(jù)引物的不同而不同?！踩橙?0-20uLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，余下的PCR產(chǎn)物-20C保存?！咀⒁馐马椗c提示】逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無RNAase環(huán)境，以防止RNA的降解。成功的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)決定于高質(zhì)量的模板RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA別離方法，如TrizolReagent，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。因此在進(jìn)行PCR反應(yīng)時應(yīng)該對每個RNA模板進(jìn)行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照反應(yīng)，以確定擴(kuò)增出來的片段是來自基因組DNA還是CDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。的起始模板可是總RNA或mRNA，都可以檢測到擴(kuò)增結(jié)果〔如以下圖〕。另外，別離mRNA會導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有基因時，使用mRNA會增加檢測的靈敏度。4/6在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNA酶抑制蛋白以增加CDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNA酶抑制蛋白要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和復(fù)原劑〔如DTT〕存在的條件下加入，因為CDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白僅防止RNaseA，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗者的手上Rnase對樣品的污染。較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65°C保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴(kuò)增可以使用經(jīng)過改進(jìn)的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如：Invitrogen公司的ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。而且適當(dāng)提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，可增加RT-PCR的特異性。建立反應(yīng)體系時，加完其它反應(yīng)物后，才加模板DNA和TaqDNA聚合酶；然后將全部反應(yīng)物渦旋混勻；上PCR儀前加礦物油封蓋或設(shè)熱蓋。反應(yīng)的循環(huán)數(shù)一般25-30次就足夠了，過多的循環(huán)數(shù)會造成非特異性擴(kuò)增和時間的浪費。復(fù)性溫度的計算，一般是在引物的Tm值上下浮動，Tm=2〔A+T〕+4〔G+C〕。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可提高PCR擴(kuò)增的特異性。8.不管是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)還是PCR反應(yīng)都應(yīng)先調(diào)制試劑的MasterMix（包括RNaseFreedH2O、緩沖液、NTPMixture等），然后分裝到每個反應(yīng)管中。這樣可使所取的試劑的體積更準(zhǔn)確，減少試劑的損失，防止重復(fù)分取同一試劑，同時也可以減少實驗操作造成的誤差。而且分裝試劑時務(wù)必用新Tip，以防止樣品間的污染。、RNaseInhibitor、Taq等酶類，要輕輕地混勻，防止起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反應(yīng)管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。酶類務(wù)必在實驗前從-20C取出，使用后立即放回-20C保存。10.最正確的PCR條件，因PCR擴(kuò)增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先做Control反應(yīng)，以確定最正確的PCR條件。