分子生物學(xué)基本技術(shù)

分子生物學(xué)基本技術(shù)包括核酸的純化，體外合成、分子雜交、基因克隆、基因表達(dá)研究技術(shù)等第一節(jié)DNA的體外合成一、DNA的化學(xué)合成（無(wú)要求）一亞磷酸三酯法DNA的化學(xué)合成廣泛用于合成寡核苷酸探針和引物，有時(shí)也用于人工合成基因和反義寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成儀合成的，大多數(shù)DNA合成儀是以固相亞磷酸三酯法為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是將所要合成的核酸鏈的末端核苷酸先固定在一種不溶性高分子固相載體上，然后再?gòu)拇四┒碎_(kāi)始將其他核苷酸按順序逐一接長(zhǎng)。每接長(zhǎng)一個(gè)核苷酸殘基則經(jīng)歷一輪相同的操作，由于接長(zhǎng)的核酸鏈?zhǔn)冀K被固定在固相載體上，所以過(guò)量的未反應(yīng)物或反應(yīng)副產(chǎn)物可通過(guò)過(guò)濾或洗滌的方法除去。合成至所需長(zhǎng)度后的核酸鏈可從固相載體上切割下來(lái)并脫去各種保護(hù)基，再經(jīng)純化即可得到最終產(chǎn)物。（末端核苷酸的3'-OH與固相載體成共價(jià)鍵，5'-OH被二甲氧基三苯甲基（DMT）保護(hù)，下一個(gè)核苷酸的5′-OH亦被DMT保護(hù)，3,-OH上的磷酸基上氨基亞磷酸化合物活化。堿基上的氨基用苯甲酸保護(hù)。每延伸一個(gè)核苷酸需四步化學(xué)反應(yīng)（1）脫DMT游離出5'-OH。（2）縮合（偶聯(lián)反應(yīng)）：新生成的5，-OH與下一個(gè)核苷活化的3'單體縮合成亞磷酸三酯使鏈增長(zhǎng)（3）蓋帽（封端反應(yīng)）：有少量（小于0.5%）未縮合的5,-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙?；忾]，以防進(jìn)一步縮合造成錯(cuò)誤延伸。（4）氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價(jià)亞磷，需用碘氧化成五價(jià)磷（磷酸三酯）。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向5,方向延伸一個(gè)核苷酸二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是一種體外特定核酸序列擴(kuò)增技術(shù)。一）PCR的基本原理雙鏈DNA熱變性成兩條單鏈，降溫使反應(yīng)體系中的兩個(gè)引物分別與兩條DNA單鏈兩側(cè)的序列特異性復(fù)性，在合適的條件下，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，利用反應(yīng)體系中的4種dNTP合成其互補(bǔ)鏈（延伸），在適宜的條件下，這種變性f復(fù)性f延伸的循環(huán)重復(fù)1次DNA的量可以增加1倍，30次循環(huán)后，DNA的量增加230倍。（二）典型PCR的反應(yīng)體系.耐熱DNA聚合酶：耐熱DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶，VENTDNA聚合酶，SacDNA聚合酶。其中Taq聚合酶應(yīng)用最廣泛。Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃時(shí)半衰期分別為40min、30min和5-6min，故PCR中變性溫度不宜高于95℃。Taq酶的最適溫度是72℃，較高溫度下的DNA合成錯(cuò)

誤率較低。因此一次加酶可滿足PCR反應(yīng)全過(guò)程的需要，使PCR走向自動(dòng)化。純化的TaqDNA聚合酶有5,—3’外切酶活性，而無(wú)3,-5‘外切酶活性，無(wú)校對(duì)活性。因此在PCR中每2X104個(gè)核苷酸中有可能摻入1個(gè)錯(cuò)誤核苷酸，這對(duì)一般的PCR產(chǎn)物分析不會(huì)有多少影響，但將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于分子克隆時(shí)，需使用更準(zhǔn)確的DNA聚合酶。在100ML反應(yīng)體系中，一般需TaqDNA聚合酶0.5-5單位，酶濃度過(guò)高，可引起非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，濃度過(guò)低則擴(kuò)增產(chǎn)物量減少。TaqDNA酶可在-20℃貯存至少6個(gè)月.PCR反應(yīng)的緩沖液：PCR的緩沖液一般制成10X,含有：500mmol/LKCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.3)；15mmol/LMgCl2;0.1%明膠。使用時(shí)要稀釋10倍。其中Tris-HCl可維持反應(yīng)體系的pH,KCl有利于引物的退火，但濃度過(guò)高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性，明膠可保護(hù)酶不變性失活，Mg2+能影響Taq酶的活性，影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增DNA的產(chǎn)率，因此要將Mg2+.引物：PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵物設(shè)計(jì)一般遵循以下原則：(1)引物長(zhǎng)度一般為15-30b,引物太短，就可能同非靶序列雜交得到不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)G+C含量G+C含量一般為40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計(jì)引物的Tm值。(3)堿基的隨機(jī)分布引物中4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，不要多個(gè)嘌呤或多個(gè)嘧啶連續(xù)出現(xiàn)。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，以免自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響與模板的退火結(jié)合。兩引物之間也不應(yīng)有互補(bǔ)性，尤其是避免3’端的互補(bǔ)而形成引物二聚體,使靶序列的擴(kuò)增量下降。(4)引物濃度引物的濃度一般為0.1-0.5Rmol/L,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。.dNTP：dNTP常用的濃度為20-200Rmol/L,而且4種dNTP的終濃度相等。dNTP濃度過(guò)高雖可加快反應(yīng)速度，但會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤參入率，適當(dāng)?shù)牡蜐舛葧?huì)提高反應(yīng)的精確度。另外，dNTP是磷酸根的來(lái)源，會(huì)與Mg2+結(jié)合，也應(yīng)注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。.模板DNA模板可以是基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、擴(kuò)增后的DNA、cDNA等,RNA的擴(kuò)增需要首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行正常PCR循環(huán)。含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA,因此PCR反應(yīng)前用機(jī)械剪切或用稀有限制酶酶解基因組DNA，以提高產(chǎn)量。PCR反應(yīng)中模板加入量一般為102-105拷貝的靶序列。.溫度循環(huán)參數(shù)變性溫度一般為在90-95℃。變性所需的時(shí)間取決于DNA的復(fù)雜性，一般用94℃30s對(duì)模板DNA進(jìn)行變性，過(guò)高的溫度及過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)降低Taq酶的活性。引物的退火溫度通過(guò)Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算得到，一般55-80℃30s。延伸溫度選在70-75℃之間，此時(shí)Taq酶活性最高。延伸反應(yīng)的時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1kb以內(nèi)延伸1min，更長(zhǎng)的片段需相應(yīng)延長(zhǎng)時(shí)間。PCR的循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度，一般25-30次。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物也越多(三)PCR技術(shù)的擴(kuò)展典型的PCR經(jīng)過(guò)一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴(kuò)展到分子生物學(xué)的各個(gè)方面，較常用的技術(shù)擴(kuò)展有：.“巢式”P(pán)CR(nestedPCR)先用一對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對(duì)引物擴(kuò)增第一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，這一PCR技術(shù)即巢式PCR。第一次擴(kuò)增所用引物稱外引物(outer-primer)，第二次擴(kuò)增作用的引物稱內(nèi)引物(inter-primer)。進(jìn)行“巢式”P(pán)CR可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)一些，且用量較少，用外引物進(jìn)行時(shí)，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進(jìn)行內(nèi)引物的PCR擴(kuò)增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進(jìn)退式"PCR(drop-in-drop-outPCR)?！俺彩健奔啊爸型具M(jìn)退式"PCR主要用于極少量模板的擴(kuò)增。.復(fù)合PCR(multiplexPCR)在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PCR主要用于同一病原體分型及同時(shí)檢測(cè)多種病原體。此外也常用于多點(diǎn)突變性分子病的診斷。.不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)兩種引物比例相差較大的PCR稱不對(duì)稱PCR。不對(duì)稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交的探針等。.反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)由于Taq酶只能以DNA為模板，當(dāng)待擴(kuò)增模板為RNA時(shí)，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，在分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。.涂片PCR(slide-PCR)直接對(duì)載玻片上細(xì)胞涂片或組織切片進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法稱涂片PCR。涂片PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測(cè)。.反向PCR(inversePCR)擴(kuò)增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中,要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進(jìn)行酶切和環(huán)化，然后直接進(jìn)行PCR，也可將已知序列酶切后再進(jìn)行PCR。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴(kuò)增。.錨定PCR(anchoredPCR)用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA3,端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。.修飾引物PCR為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5,-末端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析物結(jié)合位點(diǎn)等，這種PCR技術(shù)稱為修飾引物PCR。此外，還可將一些信號(hào)分子如熒光素、生物素等連接于引物的5,末端，當(dāng)PCR完成后可對(duì)產(chǎn)物直接進(jìn)行檢則。PCR在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。第二節(jié)核酸的分子雜交核酸分子雜交技術(shù)是分子生物中最常用的基本技術(shù)之一。其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。此雜交過(guò)程是高度特異性的。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針。待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。將核酸從細(xì)胞中分離純化后可在體外與探針雜交(膜上印跡雜交)，也可直接在細(xì)胞或組織內(nèi)進(jìn)行原位雜交。用于檢測(cè)的已知核酸片段稱之為探針(probe)。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于隨后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物是放射性核素，近年來(lái)也發(fā)展了一些非放射性標(biāo)記物。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。核酸分子雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選和酶切圖譜制作、基因組中特定基因序列的定量和定性檢測(cè)、基因突變分析以及疾病的診斷等方面。它的應(yīng)用也大大推進(jìn)了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，如基因芯片就是分子雜交技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)展的產(chǎn)物。核酸的原位雜交有廣闊的應(yīng)用前景，但現(xiàn)時(shí)操作較繁，較易出現(xiàn)假陽(yáng)性，故本節(jié)只介紹膜上印跡雜交。一、探針的種類與選擇核酸分子探針可以分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡核苷酸探針等種類。探針選擇正確與否，將會(huì)直接影響到雜交結(jié)果的分析。.基因組DNA探針幾乎所有的基因片段都可被克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中，獲得大量高純度的DNA探針。但在選擇此類探針時(shí)，要特別注意真核生物基因組中存在的高度重復(fù)序列(如人類基因組中的Alu序列)。要盡可能使用基因的編碼順序(外顯子)作為探針，而避免使用內(nèi)含子及其它非編碼順序。.cDNA探針cDNA中由于不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，因此是一種較為理想的核酸探針。但cDNA探針不易獲得，從而限制了它的廣泛應(yīng)用。另外，還須注意其中的poly(dT)產(chǎn)生的非特異性雜交問(wèn)題。.RNA探針mRNA作為探針的優(yōu)點(diǎn)是：①RNA/RNA和RNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性較DNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性高，因此雜交溫度可提高10℃左右，雜交的特異性更高；②RNA中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交較少；③雜交后可用RNase將未雜交的探針消化掉，從而使本底降低。但是，RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，mRNA作為探針，其來(lái)源極不方便。因此，一般通過(guò)cDNA克隆、甚至基因克隆經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到mRNA樣或anti-mRNA樣探針。.寡核苷酸探針寡聚核苷酸探針可根據(jù)需要隨心所欲地用DNA合成儀合成，避免了天然核酸探針中存在的高度重復(fù)序列所帶的不利影響。寡核苷酸探針長(zhǎng)度只有15-30bp，其中即使有一個(gè)堿基不配對(duì)也會(huì)顯著影響其Tm，因此它特別適合于基因點(diǎn)突變分析；另外，由于序列的復(fù)雜性降低，因此雜交所需時(shí)間也較短。需要注意的是，短寡核苷酸探針?biāo)鶐?lái)的標(biāo)記物較少，特別是非放射性標(biāo)記時(shí)，其靈敏度較低，因此當(dāng)用于單拷貝基因的Southern印跡雜交時(shí)，以采用較長(zhǎng)的探針為好。設(shè)計(jì)寡核苷酸序列用于分子雜交時(shí)應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則：(1)探針長(zhǎng)度：一般要求10-50bp。設(shè)一段寡核苷酸的長(zhǎng)度為n，則其在DNA中隨機(jī)出現(xiàn)的頻率(P)為1/4n。因此可以計(jì)算出，分析大腸桿菌基因只需12堿基長(zhǎng)的寡核苷酸探針(大腸桿菌基因組DNA含量為4X106bp,12-mer堿基順序的隨機(jī)頻率為1.7X10-7)；而對(duì)于人基因組則需17或18-mer(人基因組DNA含量為2.9X109bp,17-mer和18-mer堿基順序隨機(jī)出現(xiàn)的頻率分別為1.7X10-10和6.9X10-10)。過(guò)短則特異性降低，過(guò)長(zhǎng)則不僅合成較困難，而且延長(zhǎng)雜交時(shí)間。(2)G:C對(duì)含量:應(yīng)為40%-60%，超出此范圍會(huì)增加非特異性雜交。(3)一定不要含有探針內(nèi)部互補(bǔ)順序：即不應(yīng)有＞4bp的堿基反向互補(bǔ)配對(duì)，否則會(huì)形成探針內(nèi)部“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。(4)避免有同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)：不可＞4個(gè)，如-GGGGG-。(5)最好用計(jì)算機(jī)與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較：如果此寡核苷酸序列與非靶基因序列有70%以上的同源性或連續(xù)8個(gè)以上的堿基序列相同，則最好不用，重新設(shè)計(jì)。二、標(biāo)記物的選擇放射性核素是靈敏度極高的標(biāo)記物，但易污染環(huán)境，需嚴(yán)格的防護(hù)措施，故近年來(lái)開(kāi)發(fā)了不少非放射性標(biāo)記物，有些已達(dá)到相當(dāng)高的靈敏度，只是一些試劑價(jià)格較昂貴，目前，放射性核素仍廣泛使用，但非放射性標(biāo)記物的使用率正在日益增高。(一)放射性核素標(biāo)記物的選擇常用于標(biāo)記核酸探針的放射性核素有32P、3H和35S,有時(shí)也用14C、125I以及131I等。各種放射性核素的適用范圍是由其物理特性所決定的，表5-1列舉了上述幾種放射性核素的物理特性。(四)非放射性標(biāo)記物的選擇根據(jù)其檢測(cè)方法：非同位素標(biāo)記物可分為以下幾類：(1)半抗原：目前使用較多的非放射性標(biāo)記物是生物素和地高辛，它們都是半抗原，可以利用這些半抗原的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。(2)配體：生物素還是一種抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和鏈霉菌類抗生物素蛋白(streptavidine)的配體，可以利用親和法進(jìn)行檢測(cè)。(3)熒光素：如FITC、羅丹明類等，可以被紫外線激發(fā)出熒光進(jìn)行觀察，主要適用于細(xì)胞原位雜交。(4)化學(xué)發(fā)光：一些標(biāo)記物可與另一物質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，可以象放射性核素一樣直接對(duì)X-光膠片進(jìn)行曝光，這類標(biāo)記物可能是今后研究的主流。(5)光密度或電子密度標(biāo)記物：如金、銀等，適用于細(xì)胞原位雜交，可在光鏡下或電鏡下進(jìn)行觀察。三、探針的放射性核素標(biāo)記.切口平移法線狀、超螺旋及帶缺口的環(huán)狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板。首先，極微量的DNaseI在Mg2+的存在下，在DNA鏈上隨機(jī)形成單鏈切口。利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5'-3’核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5,末端逐步切除。同時(shí)，在DNA聚合酶I的5'-3‘聚合酶活性的催化下，在切口的3,末端-OH上合成新的DNA單鏈。如果在反應(yīng)液中含有一種或多種標(biāo)記的核苷酸(如32P-dCTP),則這些標(biāo)記的核苷酸將替代原來(lái)的核苷酸殘基，從而形成高放射活性的DNA探針。.隨機(jī)引物法隨機(jī)引物是含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，可以與任意序列的核酸雜交，形成DNA聚合酶的引物，目前市售的隨機(jī)引物為6個(gè)核苷酸殘基的各種可能排列順序共46=4090種。將變性后的模板DNA與隨機(jī)引物混合復(fù)性，在大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)催化下合成新鏈，反應(yīng)液中有[a-32P]-dNTP時(shí)，即可形成放射性核素標(biāo)記的DNA探針。加入的隨機(jī)引物越多，探針合成的起點(diǎn)越多，得到的探針會(huì)越短。3.末端標(biāo)記法利用T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶、KlenowDNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶等可以標(biāo)記探針的一端，標(biāo)記活性較切口平移法和隨機(jī)引物法低得多，一般很少用作分子雜交的探針，主要用于DNA序列測(cè)定，故不作詳細(xì)介紹。4.探針的純化探針標(biāo)記后，有時(shí)需要用凝膠過(guò)濾法除去未摻入的dNTP等小分子，收集含探針的第1鋒，有時(shí)還需用酒精沉淀探針。四、探針的非放射性標(biāo)記按照標(biāo)記方法的不同，現(xiàn)有的非放射性標(biāo)記物主要有兩種類型，一種是預(yù)先已連接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素標(biāo)記的核苷酸一樣用酶促聚合方法摻入到核酸探針上，如生物素、地高辛等。另一類是直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上。后一類標(biāo)記過(guò)程更為簡(jiǎn)單，可能是今后研究發(fā)展的主流。.酶促標(biāo)記法目前應(yīng)用最廣的非同位素標(biāo)記物是生物素(biotin)。生物素可通過(guò)一條碳鏈臂與UTP或dUTP嘧啶環(huán)的5位碳相連，連接物的堿基配對(duì)能力不變，而且仍然是許多DNA修飾酶的良好底物。碳鏈臂可長(zhǎng)可短，但臂長(zhǎng)為16或11個(gè)原子時(shí)，效果為佳。除dUTP外，一系列生物素標(biāo)記的dATP和dCTP也已被研制和應(yīng)用。德國(guó)BoehringerMannheim公司生產(chǎn)的地高辛(digoxigenin)標(biāo)記物也已被逐步推廣使用。生物素和地高辛標(biāo)記的dNTP可以用切口平移法、隨機(jī)引物法及末端移酶末端標(biāo)記法等進(jìn)行核酸探針(包括DNA、RNA和寡核苷酸探針)的標(biāo)記。但要注意，由于生物素等標(biāo)記物是連接在堿基上，而不是磷酸基團(tuán)，因此不能用多核苷酸激酶法進(jìn)行末端標(biāo)記。2.化學(xué)標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法是將標(biāo)記物與化學(xué)性質(zhì)較活潑的基團(tuán)相連，在一定條件下使活潑基團(tuán)活化而與核苷酸的特定部位共價(jià)結(jié)合，常用的有：(1)光敏生物素(photobiotin)：與核酸探針混合后，在一定條件下用強(qiáng)可見(jiàn)光照射10-20分鐘，即可與探針相連，形成的標(biāo)記探針可在-20℃下保存8-10個(gè)月，是目前常用的標(biāo)記法。標(biāo)記時(shí)DNA制品不能用Tris溶液溶解，不能含有蛋白質(zhì)，且小片段探針標(biāo)記效率偏低。(2)胞嘧啶生物素標(biāo)記法：?jiǎn)捂満怂嶂械陌奏ぴ趤喠蛩釟溻c作用下形成亞硫酸化中間物，然后與乙二胺經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用形成胞嘧啶胺衍生物，再與生物素酯反應(yīng)形成生物素酰胺衍生物。(3)生物素肼標(biāo)記法：生物素肼在磺酸的催化下與單鏈核酸中的胞嘧啶反應(yīng)，形成N4-生物素標(biāo)記的衍生物。(4)酶的直接交聯(lián)：將辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶通過(guò)化學(xué)方法直接交聯(lián)到核酸探針上，通過(guò)酶促反應(yīng)顯示探針的位置。五、膜上印跡雜交的條件選擇膜上印跡雜交操作的基本流程是:首先用凝膠電泳方法將待測(cè)核酸片段分離，然后用印跡技術(shù)將分離核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上，轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來(lái)的相對(duì)位置不變。再用標(biāo)記核酸探針與固相支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交。最后洗去未雜交的游離的探針?lè)肿?，通過(guò)放射自顯影等檢測(cè)方法顯示標(biāo)記探針的位置。由于探針已與待測(cè)核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針?lè)肿语@示的位置及其量的多少，反映出待測(cè)核酸分子中是否存在相應(yīng)的基因順序及其含量與大小。有關(guān)印跡的基本知識(shí)在第二章已經(jīng)介紹，這里主要介紹雜交條件的選擇。DNA分子雜交實(shí)質(zhì)上是雙鏈DNA變性和具同源序列的兩條單鏈復(fù)性的過(guò)程。(二)非放射性核素探針的檢測(cè)除酶直接標(biāo)記的探針外，其它非放射性標(biāo)記物并不能被直接檢測(cè)，而需經(jīng)兩步反應(yīng)將非放射性標(biāo)記物與檢測(cè)系統(tǒng)偶聯(lián)。第一步稱為偶聯(lián)反應(yīng)，第二步稱為顯色反應(yīng)。1.偶聯(lián)反應(yīng)大多數(shù)非放射性標(biāo)記物是半抗原，可以通過(guò)抗原-抗體免疫反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)。另一類非放射性標(biāo)記物如生物素，作為抗生物素蛋白(卵白素，avidin)的配體，可通過(guò)親合法進(jìn)行檢測(cè)。avidin是一種糖蛋白，有4個(gè)與生物素結(jié)合的位點(diǎn)，與生物素的親合力極高。但是，由于體內(nèi)存在內(nèi)源性生物素的干擾，同時(shí)，由于avidin為糖蛋白，中性環(huán)境下帶正電荷，易與其他帶負(fù)電荷的生物大分子非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。近年來(lái)使用的鏈親和素不是糖蛋白，等電點(diǎn)為中性，較少形成非特異性結(jié)合，特異性較高。2.顯色反應(yīng)通過(guò)連接在抗體或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。常用的檢測(cè)物質(zhì)與方法有以下幾類：(1)酶法檢測(cè)：這是最常用的檢測(cè)方法。通過(guò)酶促反應(yīng)使其底物形成有色反應(yīng)產(chǎn)物。最常用的酶是堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶。堿性磷酸酶可使其作用底物BCIP(5-bromo-4-chloro-4-indolylphosphate)脫磷并聚合，釋放出的H+使NBT(nitrobluetetrazolium,硝基藍(lán)四氮唑)還原而形成