三種熒光定量PCR檢測方法比較

三種熒光定量PCR檢測方法比較.三種熒光定量PCR檢測方法比較定量pcr：以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)展分析或?qū)CR過程進(jìn)展監(jiān)測，從而到達(dá)評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)展的。常見熒光定量PCR檢測方法可分為以下幾類：SYBRGreenI檢測模式SYBRGreenI是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光增加。因此，SYBRGreenI的熒光號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以依據(jù)熒光號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreenI的最大吸取波長約為497nm，放射波長最大約為520nm。PCR擴(kuò)增程序一般為94℃～55℃～72℃三步法，40個(gè)循環(huán)。SYBRGreenI的缺點(diǎn)SYBRGreenI是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對PCR反響中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)：SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)是由于其缺DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。水解探針模式(taqman探針)TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)放射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)展延長反響時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分別，放射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋整理版.Taqman探針檢測的是積存熒光。PCR94℃～60℃40個(gè)循環(huán)。常FAM，TET，VIC，HEX。雜交探針模式(Beacon、FRET)分子標(biāo)是一種呈發(fā)夾構(gòu)造的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子標(biāo)的莖環(huán)構(gòu)造中，環(huán)一般為10個(gè)核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖一般5-7個(gè)核苷酸長，并相互配對形成莖的構(gòu)造。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，由于模板不存在時(shí)形成莖環(huán)構(gòu)造，當(dāng)加熱變性會互補(bǔ)配對的莖環(huán)雙鏈解開，假設(shè)有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在，分子標(biāo)也是FAM，TexasRed。PCR擴(kuò)增程序通常是：94～55～72℃三步法，40個(gè)循環(huán)。整理版.FRETFRET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的5`端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一探針的3`端標(biāo)記Red640熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸取，使Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生640波長的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測號是實(shí)時(shí)號，非累積號。常用的熒光基團(tuán)是：LC-Red640，LC-Red705。整理版.能用于實(shí)時(shí)熒光PCR定量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)依據(jù)試驗(yàn)的需要和當(dāng)前的試驗(yàn)條件選擇適合自己的方法。下面為各種方法的比較：整理版.試驗(yàn)中的一些好習(xí)慣：參加試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長了濃度不均;移液用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。;多和大家爭論，同時(shí)多關(guān)注別人爭論的閱歷，這幾乎是最快提高的捷徑了;全部的試劑都自己配，出了問題才好找緣由。RNA酶污染的措施：全部的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于10℃的高溫下干烤6h或更長時(shí)間。0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(留意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用)。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，3%H2O210min0.1%DEPC水沖洗，晾干。配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hDEPC。不能高壓滅菌的試DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，試驗(yàn)過程中手套要勤換。設(shè)置RNA操作專用試驗(yàn)室，全部器械等應(yīng)為專用。RNA酶抑制劑：焦磷酸二乙酯(DEPC)RNA酶RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞構(gòu)造RNA酶有猛烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有肯定抑制作用。DEPCRNA，因此在分別和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容在全部RNA試驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分別得到全長的RNA。而試驗(yàn)失敗的主要緣由是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。整理版.RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。RNA酶最主要的潛在污染源是爭論RNA試驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。但DEPC能與胺和巰基反響,因而含Tris和DTT的試劑不DEPC處理動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法：Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培育細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+RNase封阻分析和分子克隆。N50-100mg組織參加1mlTrizolTrizol體積10%。研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液參加0.2ml15秒。mlTrizol0.5ml異丙醇的比例參加異丙醇，室溫放置10分鐘，g離心10分鐘。棄去上清液，按每mlTrizol液參加至少1ml的比例參加75%乙醇，渦旋混勻，4℃7500g5分鐘。留神棄去上清液，然后室溫或真空枯燥5-10分鐘，留意不要枯燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進(jìn)展mRNA70%乙醇并保存于-70℃。[留意]整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步肯定要留神，靠近沉淀的局部肯定要舍得不要，要不然會有蛋白質(zhì)污染，影響比值加氯仿前的勻漿液可在-70℃RNA沉70%4℃保存一周，-20℃保存一年。mRNA的提取閱歷：一、關(guān)于TrizolReagent需要的試劑Chloroform：氯仿(分析純)Isoprolalcohol：異丙醇(分析純)整理版.75%Ethanol(inDEPC-treatedwater)：75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。RNase-freewater：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500ml(50ul)，在37℃過夜，并高壓滅菌即得(1小時(shí))一次性塑料手套留意：DEPC有致癌之嫌二、關(guān)于TrizolReagent的使用過程：Homogenization(勻漿)Tissues：組織每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol10%。CellsGrowninmonolayer(單層細(xì)胞接毒后消滅病變的)JEVRNA的抽提法：BHK21細(xì)胞長成單層后，接毒0.5-1ml(承受大瓶)，37℃1h，倒掉，加維持液(2%HEPEMEM)約5ml，維持天。消滅75%-100%的病變時(shí)，以PBS(預(yù)冷)沖洗細(xì)胞兩次，直接在細(xì)胞瓶中參加Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細(xì)胞(細(xì)胞瓶有兩種常用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.ml。Trizol試劑的參加是依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，否則可導(dǎo)致DNA的污染)具體方法如下：(樣品肯定要穎)EPTrizol1ml/10cm2()，混勻，吹吸幾次，5min，以使核蛋白復(fù)合物徹底分別。加氯仿0.2ml(每1mlTrizol試劑參加氯仿0.2ml)，蓋好，15s2-3分鐘。4℃離心，g×15min，離心后，混合物將分別為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol60%。認(rèn)真吸取上層水相，移至另一EP管中。加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA(每1mlTrizol試劑參加0.5ml異丙醇)10min。4℃離心，g×10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透亮的小塊附在管底和管壁。整理版.75%1ml(1mlTrizol試劑參加75%乙醇至少1ml)，震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣枯燥(或真空枯燥)后，沉淀重懸RnasedH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃10分鐘以溶RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?9)分別組織10mg(純組織)加00ulTrizol試劑。(10)擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定。DEPC處理方法如下：DEPC處理：DEPC水：100ml超純水參加0.2mlDEPC，充分混勻，高壓滅菌。Tip頭(頭)、EPRNART時(shí)接觸RNA的器材(包括1ml、200μl、20μlTip頭;EP管和PCR反響管等)：用0.1%的DEPC水(1000ml超純水參加1mlDEPC)37浸泡過夜，高壓滅菌。提取RNADEPC水溶解。RTPCRRT是PCR反響管中作的。操作過程中要戴一次性手套，并常常換手套。最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，1-2ml0.1%DEPC水，在滅菌就行了;RNASEFREE的頭買，直接用不用處理的。如何消退污染：機(jī)器運(yùn)行完后，取出PCR產(chǎn)物時(shí)不能任憑丟棄，應(yīng)當(dāng)用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟入垃圾桶。試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶屢次取用。加樣：原則是DNA最終加，其他試劑依據(jù)體積大小從DNA不同，那么實(shí)行的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面，混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去，這樣可以有效地避開誤差及污染。另外，一般試驗(yàn)室簡潔污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個(gè)房間里有比較大的關(guān)系，最簡潔造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。整理版.RNA定量：RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計(jì)比較不同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了。RNA的貯藏，最主要的是溫度，-20不夠，最好-0，液氮最保險(xiǎn)。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，由于還有翻譯效RNA降解速度的影響。RT-PCR有兩種做法：條件具備的話可用kit進(jìn)展一步法進(jìn)展;假設(shè)條件不太好的話可分兩步進(jìn)展逆轉(zhuǎn)錄再PCR。兩步法的結(jié)果更加抱負(fù)，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象，由此推想是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)展?？隙ㄒ鰞?nèi)參的，不作內(nèi)參的結(jié)果是不行的。電泳可以不一起跑，沒有關(guān)系，計(jì)算的是相對表達(dá)程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達(dá)量，不是確定表mRNA的分別與純化中。步驟(4)中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞 RNA的二級構(gòu)造，尤其是mRNAPoly(A+)尾處的二級構(gòu)造，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。保溫試驗(yàn)：方法很簡潔的，依據(jù)樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000ngRNA0.5mlpH7.0的Tris10ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中，保溫1h。另一份放置在-20℃冰1h。時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)展電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。假設(shè)兩者的條帶全都或者無明顯差異(固然，它們的條帶也要符合方法2中的條件)，則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，假設(shè)70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染與對策：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染.這是PCR反響中最主要最常見的污染問題，所以，擴(kuò)增區(qū)的儀器什么如頭等要留意。還有一種簡潔無視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液風(fēng)光摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較猛烈