PCR引物的設(shè)計(jì)原則

PCRDNAPCR要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)構(gòu)造。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開(kāi)它。如這一段不能形成二級(jí)構(gòu)造，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。一般引物長(zhǎng)度為15~30100~600讓我們先看看P1G+C40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P14個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)展必要的修飾，例如可以在引5′端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這3′端確定不能進(jìn)展任何修飾，由于33′端不要終止33特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級(jí)構(gòu)造。15~30④G+C40%~60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。445′端可以修飾。3′端不行修飾。33PCR效地?cái)U(kuò)增模板DNAPCRPCR引物的特異性708基同源。避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)構(gòu)造區(qū)某些引物無(wú)效的主要緣由是引物重復(fù)區(qū)DNAmRNA自由能〔△G°〕58.6lkJ/mol7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP成功是有幫助的。長(zhǎng)度度會(huì)超過(guò)TaqDNA〔74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。G+CG+C40%~60%。其Tm鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm5~10℃。假設(shè)按公式Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估量引物的TmTm55~80℃，其Tm72℃以使復(fù)性條件最正確。堿根底隨機(jī)分布33GCG+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。引物自身性結(jié)合。假設(shè)用人工推斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。引物之間3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二43′端33′端也不能有形成任何二級(jí)構(gòu)造可能，除在特別的PCR〔AS-PCR〕反響中，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR2UTaqDNA800μmol/LdNTP〔四種dNTP200μmol/L〕以質(zhì)?！?03〕為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1minHIV-1gag3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有確定規(guī)律的。A∶A1/20，A∶GC∶C1/100。引物A：模板GG：模板APCR5′端5′端限定著PCR5′端修飾包括：Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DN