微生物遺傳學(xué)第四章細(xì)菌轉(zhuǎn)移課件

2023/7/30第四章細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移和基因重組2023/7/30第二節(jié)接合(conjugation)供體菌（F+）通過性菌毛與受體菌（F-）直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，并使其獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。大腸桿菌的接合能進(jìn)行接合的微生物種類主要在細(xì)菌和放線菌中進(jìn)行。細(xì)菌中，尤其G-菌較為普遍。接合還可發(fā)生在不同屬的一些菌種間。

接合的意義抗生素抗性外毒素抗性新的代謝能力2023/7/302023/7/30通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞叫接合子。介導(dǎo)接合作用的質(zhì)粒叫接合質(zhì)粒(自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、性質(zhì)粒)。2023/7/30接合的特征特征1：需要供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的直接接觸，在G-是通過質(zhì)粒編碼的性菌毛介導(dǎo)的，在G＋細(xì)菌中沒有性菌毛，由受體細(xì)胞分泌類似于性激素的短肽刺激細(xì)胞接合。2023/7/30特征2：需要質(zhì)粒參與。G-細(xì)菌中質(zhì)粒分子量較大，有幾十個(gè)tra基因參與DNA轉(zhuǎn)移，而G＋細(xì)菌中質(zhì)粒小，只有幾個(gè)tra基因參與DNA轉(zhuǎn)移。2023/7/30特征3：無論G-或G＋，質(zhì)粒能只從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移.是自然界微生物遺傳物質(zhì)交換的重要途徑。大腸桿菌，自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是F因子。2023/7/301.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)1946年，J.Lederberg&Tatum的大腸桿菌雜交試驗(yàn)：材料：大腸桿菌(E.coli)K12菌株的兩個(gè)營養(yǎng)缺陷型品系：菌株A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；菌株B—蘇氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法：將A、B兩菌株混和，在基本培養(yǎng)基(固體)上涂布培養(yǎng)。結(jié)果：平板上長出原養(yǎng)型菌落(++++)。2023/7/30+-？結(jié)果原養(yǎng)型菌株以10-5－10-6的頻率出現(xiàn)2023/7/30

質(zhì)疑：⑴細(xì)菌的雜交實(shí)驗(yàn)獲得的重組子可能是轉(zhuǎn)化的結(jié)果。⑵培養(yǎng)基中含有某些代謝產(chǎn)物，混合后這些產(chǎn)物互相補(bǔ)充了對方的不足而得以在基本培養(yǎng)基上生長。(3)回復(fù)突變2023/7/30轉(zhuǎn)化的排除（1）當(dāng)時(shí)Lederberg和Tatum已證明，把菌株A的培養(yǎng)液經(jīng)過滅菌，再加入到B菌株的培養(yǎng)液中，沒有原養(yǎng)型菌落，說明并非轉(zhuǎn)化的結(jié)果。2023/7/30證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）轉(zhuǎn)化的排除(2)2023/7/30互養(yǎng)的排除營養(yǎng)缺陷型菌株通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象稱為互養(yǎng)。如將基因型A-B+T1s和A+B-T1r兩菌株在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，接觸較短的一段時(shí)間以后，噴上噬菌體T1,把A-B+T1s殺死，經(jīng)培養(yǎng)后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)。A-B+T1sA+B-T1rT12023/7/30回復(fù)突變的排除大腸桿菌的突變率一般都是<10-8，若兩個(gè)基因同時(shí)回復(fù)突變，則可能性只有<10-16，這種幾率在平板上是很難檢測到的，所以混合培養(yǎng)能出現(xiàn)10-5-10-6頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。MCB1402/16/051514.11J.Lederberg,E.Tatum(1946)

Novelgenotypesinmixedculturesofbiochemicalmutantsofbacteria.ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.11:113-114.MCB1402/16/0516草履蟲2023/7/30W.Hayes的實(shí)驗(yàn)（1952）該實(shí)驗(yàn)說明細(xì)菌接合過程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的，即遺傳物質(zhì)從A株轉(zhuǎn)移到了B株。A:met-bio-thr+thi+B:met+bio+thr-thi-2023/7/30大腸桿菌的兩種類型Hayes(1952)研究表明：大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的；從而認(rèn)為大腸桿菌存在兩種類型：雌性與雄性，分別作為接合過程中遺傳物質(zhì)的受體與供體。供體菌稱為雄性菌，受體菌稱為雌性菌。有學(xué)者認(rèn)為，具有性菌毛的細(xì)胞可以叫做雄性，這種細(xì)絲狀的菌毛像一種分子陰莖，與缺乏性菌毛的雌性細(xì)胞交合（德迪夫1999）。威廉斯（2001）的觀點(diǎn)：“在細(xì)菌和病毒以及在所有高等生命體的主要類型中，遺傳重組現(xiàn)象的存在表明，性別的分子基礎(chǔ)是來自遠(yuǎn)古的進(jìn)化演變的產(chǎn)物”。2023/7/302023/7/302.F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)證明了細(xì)菌的接合是遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移后，Hayes偶然發(fā)現(xiàn)了作為原始供體的A菌在冰箱里存放了一年后出現(xiàn)一種變種，變種和正常的B菌雜交時(shí)缺乏將遺傳物質(zhì)傳給B菌株的能力。他把這個(gè)不育變種的一個(gè)Strr

突變型分離出來，并把它和可育的StrsA菌株一起繁殖，將其涂布在含有鏈霉素的平板上，分離后再和B菌株雜交，結(jié)果使不育的菌株回復(fù)了可育性（大約1/3恢復(fù)）。2023/7/30大腸桿菌的可育性解釋A菌株之所以能成為供體，是因?yàn)樗幸粋€(gè)性因子（sexfactor），又稱致育因子（fertilityfactor），簡稱F因子。2023/7/30F因子的特點(diǎn)大腸桿菌的供體或雄性細(xì)胞記為F＋，帶有一個(gè)性因子或致育因子F，而另一個(gè)不帶性因子F的受體細(xì)胞或雌性細(xì)胞記為F-雜交F+ХF－是可育的，雜交F-ХF-是不育的F因子可以轉(zhuǎn)移，從F+到F-，但必須通過細(xì)胞接觸F因子能自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從一個(gè)F+再把它傳遞過來。2023/7/30

F+是一種遺傳性狀，F(xiàn)因子的存在使細(xì)菌稱為F+，F(xiàn)因子的喪失使細(xì)菌成為F-，F(xiàn)+分裂仍得到F+細(xì)胞。其特性類似于染色體，但染色體基因轉(zhuǎn)移的頻率不超過10-6，F(xiàn)因子轉(zhuǎn)移的頻率高達(dá)70％以上。因此，F(xiàn)因子就是質(zhì)粒Lederberg,J.,Cavalli,L.L.,andLederberg,E.M.,Nov.1952,"SexcompatibilityinEscherichiacoli",Genetics37(6):720-7302023/7/303.F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)已經(jīng)對F質(zhì)粒的基因組進(jìn)行了全序列測定。F質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，DNA長度為99159bp（約100kb），約是大腸桿菌基因組的2％，其中1/3的基因與接合作用有關(guān)。整個(gè)基因組由3個(gè)主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)。2023/7/302023/7/30轉(zhuǎn)移區(qū)轉(zhuǎn)移區(qū)的長度為33kb，由23個(gè)基因組成，構(gòu)成一個(gè)tra操縱子。與性菌毛的形成有關(guān)?？刂苹蜣D(zhuǎn)移該區(qū)最后進(jìn)入受體細(xì)胞2023/7/30復(fù)制區(qū)復(fù)制區(qū)負(fù)責(zé)F質(zhì)粒的自我復(fù)制，F(xiàn)質(zhì)粒的自主復(fù)制區(qū)為oriV，在oriV中包含復(fù)制起點(diǎn)。F質(zhì)粒的復(fù)制是按θ型方式進(jìn)行雙向復(fù)制，是一種嚴(yán)緊型質(zhì)粒，1-2拷貝/細(xì)胞。Inc基因產(chǎn)物使細(xì)胞具有不相容性。2023/7/30插入?yún)^(qū)包含4個(gè)插入順序：2個(gè)IS3，一個(gè)IS2，1個(gè)Tn1000，它們與F質(zhì)粒的整合、切除和易位有關(guān)。2023/7/30F因子為附加體質(zhì)粒，既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（整合）到染色體上2023/7/30高頻重組(Highfrequencerecombination,Hfr)1951年Cavalli發(fā)現(xiàn)用氮芥處理F＋然后將處理后的F＋×F－

10－4

1954年Hayes也分離了Hfr品系，發(fā)現(xiàn)：

(1)Hfr使重組能力增加，但無傳遞F因子的能力，Hfr×F－

F－

(2)Hfr只能將供體基因組的一部分傳給受體，Hayes的解釋是Hfr的F因子發(fā)生了永久性改變。F＋×F－——

Hfr2023/7/304.F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)根據(jù)細(xì)胞中是否存在Ｆ因子以及其存在方式的不同，可把E.coli分以下四種相互有聯(lián)系的接合型的菌株。a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收

F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。2023/7/302023/7/30細(xì)菌接合的電鏡照片2023/7/305.F質(zhì)粒與接合作用(1)

F+×F-雜交帶有F質(zhì)粒的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與F－明顯區(qū)別。除共有大量的表面菌毛外，F(xiàn)＋還有少量性菌毛。接合作用分兩步:接合配對和DNA轉(zhuǎn)移F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。2023/7/302023/7/30F+細(xì)菌通過性毛與F-細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用，產(chǎn)生胞質(zhì)橋；

F+細(xì)菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因子的一條鏈到F-細(xì)菌中。

F因子的一條鏈一進(jìn)入F-細(xì)菌中，就在F-細(xì)菌中復(fù)制新的F因子。復(fù)制完成后，F(xiàn)-細(xì)菌變成F+，同時(shí)原有F+細(xì)胞也完成F因子另一條鏈的復(fù)制，所以轉(zhuǎn)移是F+的拷貝。最終雜交的結(jié)果是F-細(xì)菌變成F+細(xì)菌，而原有的F+細(xì)菌則不變。2023/7/30(2)Hfr×F-雜交Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此為高頻重組菌株。質(zhì)粒通過不同的機(jī)理整合到染色體上，包括質(zhì)粒和染色體序列的同源重組。正常的重組需要兩個(gè)DNA之間有同源性，但大多數(shù)質(zhì)粒的序列具有不同于染色體的獨(dú)特性。但質(zhì)粒和染色體有共同插入序列和轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子間的同源重組可導(dǎo)致質(zhì)粒的整合。2023/7/30插入如何產(chǎn)生Hfr?大腸桿菌染色體有7個(gè)IS1、13個(gè)IS2和6個(gè)IS3，F(xiàn)質(zhì)粒有1個(gè)IS2和2個(gè)IS3，因此大腸桿菌染色體上有19個(gè)IS介導(dǎo)的Hfr形成位點(diǎn)。F質(zhì)粒插入染色體上位置隨機(jī)，方向隨機(jī)，結(jié)果產(chǎn)生不同的Hfr菌株。2023/7/30Hfr菌株的形成及其基因重組2023/7/30Hfr與F-菌株接合過程Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng)OriT序列被酶識別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。F因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。2023/7/30Hfr與F-菌株接合結(jié)果Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早，頻率也高。2023/7/302023/7/30（3）F′×F-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：供體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction），或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediatedtransduction）。2023/7/302023/7/302023/7/30部分二倍體：

當(dāng)Hfr菌的部分染色體進(jìn)入F－細(xì)胞后，F(xiàn)－細(xì)胞中就成為部分二倍體（partialdiploid）或部分合子（merozygote）。2023/7/306.中斷雜交（interruptedmating）技術(shù)Hfr細(xì)菌和F-接合后，染色體按一定速度和方向進(jìn)入F-，由于DNA轉(zhuǎn)移從oriT起始，F(xiàn)質(zhì)粒的主要部分應(yīng)該在最后進(jìn)入受體，但雜交后，F(xiàn)-并不轉(zhuǎn)變?yōu)镕＋說明大部分F因子并沒有進(jìn)入受體。利用Hfr×F-的接合過程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時(shí)間(分鐘)為單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。2023/7/30中斷雜交實(shí)驗(yàn)作圖

(interruptedmatingexperiment)中斷雜交實(shí)驗(yàn)1957年E.Wollman和E.Jacob設(shè)計(jì)完成供體：Hfrstrsthr＋leu＋azirtonr

lac＋gal＋受體：F－ strr

thr－

leu－azistons

lac－gal－中斷雜交F－Hfr雜交一定時(shí)間間隔基本培養(yǎng)基含鏈霉素thr+leu+strr重組子2023/7/30將大約10倍的F-菌和Hfr對數(shù)期的菌混合，輕輕振蕩培養(yǎng)，在不同時(shí)間間隔取樣，然后在組織攪拌器中劇烈振蕩。振蕩后的培養(yǎng)物涂布于加了鏈霉素的基本培養(yǎng)基上，篩選thr+leu+strr重組子。再對每一個(gè)重組子的非選擇性標(biāo)記azitonlacgal進(jìn)行測定。2023/7/302023/7/30從圖可知，混合5分鐘后取樣時(shí)，所得菌落的非選擇標(biāo)記全部和F-菌株相同，表明還沒有任何Hfr菌的基因進(jìn)入受體菌。混合10分鐘取樣，重組體中有10％含Hfr的azi基因，但幾乎沒有ton和gal基因，25分鐘時(shí)，gal基因才出現(xiàn)。在60分鐘后，thr+leu+strr重組體的數(shù)目達(dá)到最高點(diǎn)，非選擇性供體標(biāo)記趨于平衡。在這些重組體之間，非選擇性供體標(biāo)記從azi基因的90％到gal基因的25％。因此Hfr和F雜交建立起穩(wěn)定的接合對時(shí)，供體的染色體的轉(zhuǎn)移是從一個(gè)固定點(diǎn)開始的，以0－t