有機混合物分離課件

有機混合物的分離有機分析有機混合物的分離有機分析11、物理分離法物理分離法是利用有機物揮發(fā)性、溶解性等的差別進行分離。在分離過程中，不改變化合物的組成和結(jié)構(gòu)，通常采用的方法有以下幾種。(1)蒸餾法在分析實驗中，蒸餾是分離液體混合物最常用的方法。根據(jù)各組份對熱的穩(wěn)定性、揮發(fā)性和蒸汽壓大小來選用不同的蒸餾方法。有機分析一、混合物分離的一般步驟1、物理分離法有機分析一、混合物分離的一般步驟2(2)萃取法液液萃取液固萃取(3)重結(jié)晶和升華有機分析索氏萃取器

純化固體物質(zhì)的方法重結(jié)晶：不同物質(zhì)在溶劑的溶解度差別升華：組分間的蒸汽壓差別(2)萃取法有機分析索氏萃取器純化固體物質(zhì)的方法重結(jié)晶：不32、化學分離法有些有機混合物中的各組份的物理性質(zhì)十分接近，找不到定量分離的方法，就必須根據(jù)各組份的化學性質(zhì)，加以化學處理，使組份轉(zhuǎn)變?yōu)樾再|(zhì)差異較大的化合物，然后進行分離。分離后再用適當?shù)脑噭┨幚恚怪優(yōu)樵瓉淼幕衔铩?/p>

有機分析2、化學分離法有機分析43、二元混合物的分離（1）根據(jù)溶解性差別根據(jù)相似相溶原理，采用極性或非極性溶劑進行分離水溶性和非水溶性：丙醇、溴丙烷極性差別：二乙胺、乙二胺（弱、強）溶解度不同：苯甲酸、對苯二甲酸（乙醚）3、二元混合物的分離（1）根據(jù)溶解性差別5（2）根據(jù)揮發(fā)性差別蒸餾法單官能團化合物易蒸發(fā)：乙醇、乙酸、苯甲酸多官能團化合物不易蒸發(fā)：乙二醇、草酸、鄰苯二甲酸7個碳以下的烷烴、芳烴、環(huán)烷烴；3~5個碳以下的醇、醛、醚以及低級鹵代烴、胺等化合物沸點較低，可直接用氣相色譜法分離。（2）根據(jù)揮發(fā)性差別蒸餾法6（3）利用化學性質(zhì)的差別利用混合物中各組分酸堿性的差別，能和不同的成鹽試劑反應(yīng)成鹽的原理，將不同組分轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙庑?、揮發(fā)性差異較大的化合物。羧酸、磺酸、酚類胺類鈉鹽鹽酸鹽（3）利用化學性質(zhì)的差別利用混合物中各組分酸堿性的差別，能和7①酸性和中性物①酸性和中性物8②堿性和中性物②堿性和中性物9③弱酸與強酸③弱酸與強酸10④利用特殊反應(yīng)伯仲叔胺——興士堡試驗（苯磺酰氯）醛與烴類（或其他不溶于水的中性化合物）苯甲醛苯亞硫酸氫鈉羥基磺酸鈉不反應(yīng)④利用特殊反應(yīng)伯仲叔胺——興士堡試驗（苯磺酰氯）苯甲醛苯亞硫114、多元混合物的分離了解試樣的來源，以提供試樣可能的化學成分。觀察試樣的物態(tài)，如是固、液混合物，可用過濾方法將其初步分離，若為互不相溶的液態(tài)混合物，可用分液漏斗進行萃取分離。檢查試樣是否含水。溶解性試驗。甲醇、乙醇、四氯化碳、苯等。揮發(fā)性與灼燒試驗。試樣酸堿性試驗。元素及官能團定性鑒定。4、多元混合物的分離了解試樣的來源，以提供試樣可能的化學成分12多元混合物的分離方案多元混合物的分離方案13有機混合物分離課件14思考題用流程圖的形式表明下列混合物的分離程序1.硝基苯苯胺苯酚苯甲酸2.丙酮苯甲酸乙二胺思考題15二層析分離知識點：色層分離法的分類及其概念。紙層析技術(shù)，薄層層析技術(shù)，柱層析技術(shù)，離交層析技術(shù)。重點：上述各技術(shù)的原理、操作方式、操作過程、所用裝置和材料的選擇、適用范圍。二層析分離知識點：色層分離法的分類及其概念。紙層析技術(shù)，16目錄1層析法概述2紙層析3薄層層析4柱層析5離子交換吸附層析目錄1層析法概述171層析法概述（1）引言（2）層析的發(fā)展史（3）層析的分類（4）層析劑1層析法概述（1）引言18（1）引言層析原理色譜（層析）法應(yīng)用范圍色譜技術(shù)的提出（1）引言19有機混合物分離課件20（2）層析的發(fā)展史（2）層析的發(fā)展史21（3）層析的分類①根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機理不同的分類凝膠過濾法分配層析法離子交換色層分離法吸附層析法疏水作用色層分離法金屬螯合色層分離法共價作用色層分離法（3）層析的分類①根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機理不同的22有機混合物分離課件23吸附色譜與其它色譜法的異同點

吸附色譜與其它色譜法的異同點24②根據(jù)實驗技術(shù)的分類低壓層析技術(shù)中壓層析技術(shù)高壓層析技術(shù)電泳法——操作壓力在0.5MPa-5MPa之間——操作壓力在5Mpa-40MPa之間——操作壓力小于0.5MPa——靠溶質(zhì)分子在電場中的移動速度不同而分離②根據(jù)實驗技術(shù)的分類低壓層析技術(shù)中壓層析技術(shù)高壓層析技術(shù)電25③根據(jù)固定相的形狀不同的分類：

柱層析法紙層析法薄層層析法固定相為以氫鍵與纖維素羥基結(jié)合的水固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機玻璃柱中固定相在玻璃平板上鋪成薄層③根據(jù)固定相的形狀不同的分類：柱層析法紙層析法薄層層析法固26④根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類

氣相層析法液相層析法液相層析法流動相為氣體流動相為液態(tài)流動相為液態(tài)④根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類氣相層析法液相層析法液相層析27⑤操作方式不同的分類迎頭法頂替法洗脫分析法將混合物溶液連續(xù)通過固定相，只有化學親和力最弱的組分以純粹狀態(tài)最先流出，但其它各組分都不能達到分離。利用一種化學親和力比各被結(jié)合組分都強的物質(zhì)來洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。將混合液盡量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。⑤操作方式不同的分類迎頭法頂替法洗脫分析法將混合物溶液連續(xù)通28（4）層析劑種類⑴氧化鋁⑵硅膠⑶活性炭⑷瓊脂糖⑸纖維素（4）層析劑種類⑴氧化鋁292紙層析法（1）基本原理（2）影響Rf值的主要因素（3）層析條件的選擇（4）操作方法2紙層析法（1）基本原理30(1)基本原理

濾紙一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氫鍵與濾紙纖維上的羥基結(jié)合，一般情況下較難脫去。紙上層析實際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機溶劑(與水不相混溶或部分混溶)作為流動相。展開時，有機溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度因此不同，從而達到分離的目的。

(1)基本原理31小實驗當濾紙接觸到溶劑時，溶液將上升。濾紙上的小圓點是4種不同的氨基酸的混合物?？纯唇酉聛頃l(fā)生什么事情…小實驗當濾紙接觸到溶劑時，溶液將上升。32可以看出1號氨基酸上升的最高，在濾紙上跑得最快。而4號氨基酸與濾紙的結(jié)合最緊，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234可以看出1號氨基酸上升的最高，在濾紙上跑得最快。123433這就是紙層析法。對照上圖，可知道1-4號的各代表什么氨基酸。紙層析法是分離鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸組成的重要工具。

1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸34紙層析小實驗動畫演示紙層析小實驗動畫演示35有機混合物分離課件36溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用Rf值表示：

Rf=a/b式中a：溶質(zhì)斑點中心的移動距離

b：溶劑前沿移動的距離

Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對物質(zhì)進行定性分析。

溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用Rf值表示：37(2)影響Rf值的主要因素

①物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性

物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響Rf值的主要因素。極性較大的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其Rf值就較小，反之亦然。②濾紙

不同濾紙的厚薄程度和纖維松緊度各不相同，因此結(jié)合的水量不一樣，兩相的體積比也就不同。所以同一種物質(zhì)在不同型號的濾紙上進行層析時，所得到的Rf值也不相同。此外，濾紙上所含的雜質(zhì)也會影響Rf值，必要時要進行預(yù)處理，以去除雜質(zhì)的影響。例如：可用0.01-0.4mol/L的HCl處理濾紙，以除去濾紙上的金屬離子，然后再用水洗至中性。層析濾紙由高純度的棉花制成。要求質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機械強度，并具有一定的純度。國產(chǎn)新華濾紙、日本東洋濾紙等均經(jīng)常被采用。

(2)影響Rf值的主要因素①物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性38③層析所用的溶劑

同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進行層析時，Rf值不同。所以溶劑的配制和使用必須嚴格，才能使Rf值的重現(xiàn)性好。在好的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的Rf值應(yīng)在0.05-0.85之間，樣品中被分離組分的Rf之差最好大于0.05。溶劑系統(tǒng)中的試劑若純度不夠，需經(jīng)過預(yù)處理后才能使用。處理的方法因溶劑的性質(zhì)而異。常用的處理方法有：酸、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等。舉例如下：(1)苯酚：重蒸餾，收集180℃的餾分。(2)乙酸：在冰醋酸中加入1%重鉻酸鉀，蒸餾，收集118℃的餾分。(3)正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氫氧化鈉溶液洗滌，再用無水碳酸鉀脫水，用磨口蒸餾器蒸餾，收集117℃的餾分。

③層析所用的溶劑39④pH值

溶劑和樣品的pH值會影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf值改變。溶劑的酸堿度增大則流動相的含水量增高，使極性物質(zhì)的Rf值增加；反之則降低。為了避免或減少pH值對Rf值的影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定的pH值，通過調(diào)節(jié)溶劑或樣品溶液的pH值，使pH值保持恒定。④pH值40⑤溫度

溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用，即影響固定相的體積；同時在多元溶劑系統(tǒng)中，溫度顯著地影響溶劑系統(tǒng)的含水量，即影響流動相的組分比例。所以溫度的改變使Rf值變化很大，為此，層析必須在恒溫條件下進行。某些對溫度敏感的溶劑系統(tǒng)，最好不要配成飽和溶液。如水飽和的酚溶液，可改成酚∶水＝4：1或5：1等。⑤溫度41⑥展開方式

同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，用不同的展開方式進行層析時，所得到的Rf值不相同。用下行法展開時，Rf值較大；用上行法展開時，Rf值較??；用圓形濾紙層析時，由于內(nèi)圈較外圈小，限制了溶劑的流動，Rf值也較小。⑦樣品溶液中雜質(zhì)

樣品溶液中存在雜質(zhì)時，有時對Rf值有所影響。例如：氯化鈉的存在會影響氨基酸的Rf值。

⑥展開方式42(3)層析條件的選擇①層析紙的選擇和處理要求濾紙質(zhì)地均勻。濾紙要純凈；不含影響展開效果的雜質(zhì)；也不應(yīng)與所用顯色劑起作用。濾紙對溶劑的滲透速度適宜有機分析(3)層析條件的選擇有機分析43濾紙的選用濾紙的選用44②展開劑的選擇溶劑系統(tǒng)與被分離物質(zhì)之間不應(yīng)起化學反應(yīng)。物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)最好不受或少受溫度變化的影響，并在兩相中的分配能迅速達到平衡。這樣易于得到圓形斑點。揮發(fā)性較好，使濾紙在展開后易于干燥。被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中Rf值應(yīng)在0.1～0.85之間。兩個被分離物質(zhì)的Rf值之差應(yīng)大于0.05。有機分析②展開劑的選擇有機分析45一般不使用單一有機溶劑作展開劑，多采用水飽和的一種或幾種有機溶劑作展開劑。常用溶劑：石油醚、苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸極性逐漸增強紙層析條件的選擇最終還必須通過實踐來決定。一般不使用單一有機溶劑作展開劑，多采用水飽和的一種或幾種有機46羧酸C1~C9溶劑：（1）95%乙醇100mL，濃氨水1mL（2）正丁醇，冰乙酸，水（12：3：5）顯色劑：0.06%溴酚藍的乙醇溶液50mL，加30%氫氧化鈉0.25mL紙上層析常用溶劑及顯色劑羧酸C1~C9紙上層析常用溶劑及顯色劑47紙上層析常用溶劑及顯色劑酚溶劑：（1）正丁醇，冰乙酸，水（4：1：5）（2）正丁醇，水，苯（1：9：10）顯色劑：硝酸銀的氨溶液5%三氯化鐵的50%甲醇溶液，加熱紙上層析常用溶劑及顯色劑酚48胺溶劑：（1）正丁醇，冰乙酸，水（4：1：5）（2）2-丁酮，丙酸，水（15：5：6）顯色劑：0.2%茚三酮的丙酮溶液，碘蒸氣（用于叔胺）紙上層析常用溶劑及顯色劑胺紙上層析常用溶劑及顯色劑49紙上層析常用溶劑及顯色劑醛、酮的2，4-二硝基苯腙溶劑：乙醚-己烷丙酮-己烷顯色劑：本身有色紙上層析常用溶劑及顯色劑醛、酮的2，4-二硝基苯腙50合成燃料溶劑：（1）正丁醇，乙醇，水（4：1：5）（2）2-丁酮，丙酸，水（15：5：6）顯色劑：本身有色醇的3，5-二硝基苯甲酸酯溶劑：20%1，4-二氧六環(huán)溶液顯色劑：0.5%α-萘胺溶液紙上層析常用溶劑及顯色劑合成燃料紙上層析常用溶劑及顯色劑51(4)操作方法①樣品處理

用作紙層析的樣品，應(yīng)盡可能除雜純化。調(diào)節(jié)到一定的pH值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則需稀釋。②點樣

將濾紙裁成適當大小，用鉛筆在距邊線2cm左右劃一直線(稱為原線)，線上每隔2-3cm劃一圓點(稱為原點)。然后用點樣器(定性分析可用普通毛細管，定量分析需用微量注射器)輕輕點在原點上。樣品點的直徑約0.3-0.5cm。點樣的量應(yīng)根據(jù)紙的長短以及樣品的性質(zhì)來決定，一般每一樣品的量為5-30μg。點樣一般采用少量多次，每點一次必須用冷風吹干，然后再點第二次。每次點樣的位置應(yīng)完全重合，否則會出現(xiàn)斑點畸形現(xiàn)象。(4)操作方法①樣品處理52③平衡

點樣以后展開以前先將濾紙與層析缸用配好的溶液系統(tǒng)的蒸汽來飽和，這個過程稱之為“平衡”。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽飽和，在層析過程中，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，從而改變?nèi)軇┫到y(tǒng)的組成，嚴重時紙上會出現(xiàn)不同水平的溶劑前沿，嚴重影響層析效果。平衡一般在密閉的層析缸內(nèi)進行。

③平衡53④展開

平衡結(jié)束后，將濾紙靠樣品點的一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約1cm，此時即開始展開。當溶劑前沿到達濾紙另一端0.5-1cm處時，展開結(jié)束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標記，晾干或用冷風吹干。

④展開54按溶劑在濾紙上流動的方向不同，展開有上行、下行和環(huán)行三種方式。

a、上行法：將濾紙點樣的一端向下浸入溶劑中，溶劑因毛細管引力的作用從下向上流動。上行法操作簡單，重現(xiàn)性好，是最常用的展開方法，但展開時間較長。

b、下行法：在層析缸上部有一盛展開劑的液槽，將濾紙點樣的一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動。下行法展開速度快，但Rf值的重現(xiàn)性較差，斑點易擴散。有機混合物分離課件55有機混合物分離課件56c、環(huán)行法：又稱水平法，樣品點于圓形濾紙距圓心1cm左右的環(huán)形線(原線)上。濾紙水平放置，溶劑由濾紙條引向圓心，然后不斷向四周水平方向流動。由于溶劑向圓周方向擴散，所以展開的圖譜呈弧形。用環(huán)行法展開時，最好使用無方向性的特制濾紙。如東洋51UH濾紙等。

c、環(huán)行法：又稱水平法，樣品點于圓形濾紙距圓心1c57d、雙向展開法：如果樣品組分較多，用一種溶劑系統(tǒng)（常為酸性）不能將各組分全部分開時，可將樣品點在方形濾紙的一角，用一種溶劑系統(tǒng)展開后吹干溶劑，將濾紙轉(zhuǎn)動90℃后再用另一種溶劑系統(tǒng)（常為堿性）展開，這稱為“雙向展開法”。d、雙向展開法：如果樣品組分較多，用一種溶劑系統(tǒng)（常為酸性）58上行法是否適合Rf值較小的物質(zhì)分離？上行法是否適合Rf值較小的物質(zhì)分離？59⑤顯色

為了顯示層析斑點位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，采用顯色劑顯示或紫外光顯示。(1)顯色劑顯示：被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色的化合物，顯示斑點位置。常用噴霧法、浸漬法或涂刷法。(2)紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會發(fā)出熒光，如維生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)的斑點。⑥定性分析

層析后的斑點顯示出來后，計算出各斑點的Rf值，就可以對物質(zhì)進行定性。⑤顯色60⑦定量分析

對被分離的物質(zhì)進行定量的方法很多，常用的有：a、剪洗比色法：將斑點剪下，用適當?shù)娜軇┫疵摵?，通過分光光度計進行比色定量。b、直接比色法：用特制的分光光度計直接測量濾紙上斑點顏色的濃度，畫出曲線，由曲線所包含的面積可求出待測物的含量。c、面積測量法：實驗證明，圓形或橢圓形斑點的面積與物質(zhì)含量的對數(shù)成正比。所以，可用測量斑點面積的方法求得物質(zhì)的含量。

⑦定量分析613薄層層析法（1）薄層層析原理（2）吸附劑的選擇與處理（3）展開劑的選擇（4）薄層板的制作

（5）層析方法

3薄層層析法（1）薄層層析原理62（1）薄層層析基本原理

薄層層析是將作為固定相的支持劑均勻地鋪在支持板(一般是玻璃板)上，成為薄層，把樣品點到薄層上，用適宜的溶劑展開，從而使樣品各組分達到分離的層析技術(shù)。如果支持劑是吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，則稱之為薄層吸附層析；如果支持劑是纖維素、硅藻土等，層析時的主要依據(jù)是分配系數(shù)的不同，則稱之為薄層分配層析；同理，如果支持劑是離子交換劑，則稱為薄層離子交換層析；薄層若由凝膠過濾劑制成，則稱為薄層凝膠層析。

（1）薄層層析基本原理63優(yōu)點：快速、展開時間短。分離能力強：斑點小而清晰。靈敏度高：能檢出幾微克至幾十微克的物質(zhì)，比紙層析靈敏10～100倍。顯色方便，能直接噴灑腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸等?？梢愿邷刈茻?。應(yīng)用面廣：可用于微量成分的分析，也可作制備層析。缺點：Rf值的重現(xiàn)性比紙層析差，對生物大分子物質(zhì)的分離效果不大理想。優(yōu)點：64（2）吸附劑的選擇與處理

薄層層析的吸附劑種類很多。使用時應(yīng)根據(jù)欲分離物質(zhì)的種類進行選擇。支持劑顆粒大小要適當。顆粒大，展開速度快。但顆粒過大時，分離效果不好；而顆粒過小，則展開速度太慢，容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。一般有機類支持劑如纖維素粉的顆料為70-140目(直徑0.1-0.2mm)，薄層厚度為1-2mm；無機類支持劑如氧化鋁、硅膠等的顆粒一般為150-300目，薄層厚度為0.25-1mm。在薄層層析中，使用較多的是硅膠、氧化鋁等吸附劑，其處理方法同吸附柱層析。同樣，用離子交換劑，凝膠過濾劑等為支持劑時，支持劑均要按柱層析處理填料的相應(yīng)方法處理。

（2）吸附劑的選擇與處理65（3）展開劑的選擇薄層層析所用展開劑主要是低沸點的有機溶劑，一般使用2～3種組分的多元溶劑系統(tǒng)。在選擇展開劑時，應(yīng)根據(jù)展開劑的極性、被測物的極性及吸附劑的活性三個方面來考慮。

三角圖形法可作為一個初步估計的方法。（3）展開劑的選擇66有機混合物分離課件67通過試驗選擇展開劑，常用下面兩種方法：微量圓環(huán)法載玻片法通過試驗選擇展開劑，常用下面兩種方法：68

（4）薄層板的制作

支持板要表面平整、光滑，用前應(yīng)洗凈、干燥。常用的薄層板有硬板(濕板)與軟板(干板)之分。在支持劑中加入粘合劑(鍛石膏、淀粉、羧甲基纖維素鈉鹽等)，調(diào)成糊狀物所制成的薄層板為硬板，用粉狀支持劑直接制成的薄層板為軟板。硬板粘牢在支持板上，調(diào)成糊狀物噴顯色劑時不會沖散，可以直立展開，而軟板只能接近水平展開。

（4）薄層板的制作69薄層板常用的制作方法有：

1.浸涂法：將玻璃板在調(diào)好的支持劑漿液中浸一下，使?jié){液在玻璃板上形成薄層。2.噴涂法：用噴霧器將調(diào)好的漿液噴在玻璃板上，形成薄層。3.傾斜涂布法：將調(diào)好的支持劑漿液倒在玻璃板上，然后將玻璃板前后左右傾斜，使支持劑漫布于整塊玻璃板上而形成薄層。

4.推鋪法：在一根玻璃棒的兩端適當距離處分別繞幾圈膠布條，膠布條的圈數(shù)視所需薄層厚度而定，然后把準備好的支持劑倒在玻璃板上，用玻璃棒壓在玻璃板上，將支持劑均衡地向一個方面推動，而制成薄層。

薄層板常用的制作方法有：70推鋪法既適用于干板的涂布和濕板制作。其他方法只能用于濕板制作。濕板制作中的一個重要環(huán)節(jié)是調(diào)漿，一般支持劑與蒸餾水或緩沖液之比一般為1∶2至1∶2.5。調(diào)漿時要調(diào)和均勻，但不宜用力過猛，以免產(chǎn)生氣泡而影響分離效果。薄層板涂好后，讓其自然干燥后方能使用。若為吸附薄層層析，制好板后還需加熱活化，目的是使其減少水分而具有一定有吸附能力。推鋪法既適用于干板的涂布和濕板制作。其他方法只能用于濕板制作71

（5）層析方法

1.點樣

點樣操作與紙上層析相似。點樣前，先將制好的薄層修整一下，然后在距一端2cm左右處劃一原線，并每隔2cm左右劃一原點。樣品用合適的溶劑溶解，吸附薄層層析一般用氯仿、乙醇等有機溶劑溶解，不宜用水溶解。點樣可用微量注射器，或微量吸管、毛細管。點樣量一般在50μg之內(nèi)，點樣體積不宜超過20μL。樣品液可直接點在薄層板的原點上。也可點在圓形濾紙片上(直徑2-3mm)，再把濾紙片小心地放在薄層板原點上，并加少許可溶性淀粉糊，使濾紙片粘牢在薄層板上。

（5）層析方法72有機混合物分離課件732.展開

展式方式與紙層析一樣，有上行法、下行法等，但軟板薄層只能近水平展開(與水平成10o-20o)。吸附薄層層析所用展開劑主要是低沸點的有機溶劑，一般采用2-3種組分的多元溶劑系統(tǒng)。展開劑的選擇是根據(jù)被分離物極性、溶劑的極性以及支持劑的特性三方面來考慮。分配薄層層析展開劑的選擇與紙上層析相似。離子交換薄層層析、凝膠過濾薄層層析展開劑的選擇則與相應(yīng)柱層析的洗脫劑的選擇相同。

2.展開743.顯色

薄層層析展開后，如果樣品本身有顏色，就可直接看到斑點所在位置。若是無色物質(zhì)，則需加以顯色。顯色方法與紙層析一樣，可用顯色劑顯色，也可用紫外光顯色。此外，如果薄層板是由無機物質(zhì)制成的，還可以用強腐蝕性的顯色劑，如硫酸、硝酸、鉻酸或它們的混合物，這些強酸幾乎可以使所有有機化合物變?yōu)樘?，而成黑色斑點，但不能用于定量分析。3.顯色754.定性與定量分析

薄層層析法與紙層析一樣，用Rf值來表示被分離物質(zhì)在薄層上的位置，與已知標準物質(zhì)的Rf對照，可進行定性分析。定量分析時，可把斑點所在位置的支持劑連同物質(zhì)一起刮下，然后用適當溶液將其從支持劑上溶解下來，再測定其含量。用目測法比較樣品斑點和對照品斑點的顏色深度和面積大小，或測量斑點的面積，可以進行半定量分析和限度檢查，有條件時，可用薄層掃描儀進行定量分析。

4.定性與定量分析76/v/b/20204750-1605129293.html/v/b/277圖1芍藥甙薄層層析掃描圖圖2丹皮酚薄層層析掃描圖圖1芍藥甙薄層層析掃描圖圖2丹皮酚薄層層781、為什么不能用開裂的薄板來展開？2、薄板展開時如果展開缸不密閉會引起什么結(jié)果？3、要分離一個酸性化合物，使用哪種吸附劑比較好？1、為什么不能用開裂的薄板來展開？794、吸附柱層析(1)基本原理(2)吸附劑的選擇(3)洗脫滌的選擇(4)操作4、吸附柱層析(1)基本原理80（1）基本原理

將吸附劑填裝在玻璃或不銹鋼管中，構(gòu)成層析柱，層析時欲分離的樣品自柱頂加入，當樣品溶液全部流入吸附層析柱后，再加入溶劑沖洗。沖洗的過程稱為洗脫，加入的溶劑稱為洗脫劑。

（1）基本原理將吸附劑填裝在玻璃或不銹鋼管中，構(gòu)成81有機混合物分離課件82

在洗脫過程中，柱內(nèi)不斷地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸附的過程。即被吸附的物質(zhì)被溶劑解吸而隨溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒被再吸附，后面流下的溶劑又再解吸而使其下移動。經(jīng)過一段時間以后，該物質(zhì)會向下移動一定距離。此距離的長短與吸附劑對該物質(zhì)的吸附力以及溶劑對該物質(zhì)的解吸(溶解)能力有關(guān)。不同的物質(zhì)由于吸附力和解吸力不同，移動速度也不同。吸附力弱而解吸力強的物質(zhì)，移動速度就較快。經(jīng)過適當?shù)臅r間以后，不同的物質(zhì)各自形成區(qū)帶，如果被分離的是有色物質(zhì)的話，就可以清楚地看到色帶(色層)。如果被吸附的物質(zhì)沒有顏色，可用適當?shù)娘@色劑或紫外光觀察定位，也可用溶劑將被吸附物從吸附柱洗脫出來,再用適當?shù)娘@色劑或紫外光檢測，以洗脫液體積對被洗脫物質(zhì)濃度作圖，可得到洗脫曲線。吸附柱層析成敗的關(guān)鍵是選擇合適的吸附劑、洗脫劑和操作方式。

在洗脫過程中，柱內(nèi)不斷地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸83(2)吸附劑的選擇常用的吸附劑有極性的和非極性的兩種。羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁和人造沸石屬前者，活性炭屬后者。在實踐中不論選擇那種類型的吸附劑，都應(yīng)具備表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強和成本低廉等性能。在選擇具體吸附劑時，主要是根據(jù)吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)進行的。一般來說，極性強的吸附劑易吸附極性強的物質(zhì)，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但是為了便于解吸附，對于極性大的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑，反之亦然。理想的吸附劑必需經(jīng)過多次試驗才能獲得。

(2)吸附劑的選擇常用的吸附劑有極性的和非極性的84羥基磷灰石

羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，簡稱HA]的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。有時有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，經(jīng)過一次HA柱層析，就能達到有效的分離。

羥基磷灰石85使用HA作為固定相基質(zhì)的注意事項：

(1)HA系干粉時，要先在蒸餾水中浸泡，使其膨脹度(水化后所占有的體積)達到2-3mL/克后，再按1∶6體積加入緩沖液懸浮，以除去細小顆粒；(2)HA懸浮液須用旋渦振蕩器混合，若用磁棒或玻棒攪拌時，HA的晶體結(jié)構(gòu)會被破壞；(3)忌用檸檬酸緩沖液和pH＜5.5的緩沖液。當用過的HA層析柱再生時，要先挖去頂部的一層HA，然后用一倍床體積的1mol/LNaCl溶液洗滌，接著用4倍床體積的平衡液洗滌平衡，如此處理后即可使用；(4)就操作容量來說，細顆粒HA比粗的大。而從分辨率比較，細的比粗的好。用細顆粒HA層析時，柱子直徑應(yīng)大些才能達到滿意的流速。

使用HA作為固定相基質(zhì)的注意事項：862.硅膠

最常用的吸附劑，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強的吸附力。

2.硅膠87水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去的水稱自由水，若自由水含量達17%以上，則吸附力極低，此時，硅膠只能用于分配層析。若將硅膠在105-110℃加熱30min，吸附能力顯著增強，這一過程稱為活化。如果將硅膠加熱到500℃，硅醇基結(jié)構(gòu)會變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，吸附能力顯著下降。

硅膠具有微酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體等。水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去的水稱自883.氧化鋁

分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的酯類等化合物。

氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400℃高溫下加熱6h，使氧化鋁的含水量在0%-3%之間，可得到Ⅰ級或Ⅱ級氧化鋁，但溫度過高也會破壞氧化鋁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。4.大孔吸附樹脂和聚酰胺近年用于中藥活性成分的分離。

3.氧化鋁89

(3)洗脫滌的選擇

洗脫劑指的是溶解被吸附樣品和平衡固定相的溶劑。合適的洗脫劑應(yīng)符合下列條件：①純度較高；②穩(wěn)定性好；③能較完全洗脫所分離的成分；④黏度??；⑤易和所需要的成分分開。

(3)洗脫滌的選擇90洗脫劑根據(jù)分離物中各成分的極性、溶解度和吸附劑的活性來選擇。洗脫劑的濃度大小和極性強弱的選擇，需通過試驗確定。選擇洗脫劑的順序是由極性小到極性大(正向?qū)游?。當把極性小的洗脫劑換成極性大的時，宜先將極性大的和極性小的洗脫劑混合使用，濃度則由低到高?？傊?，選用洗脫劑的原則是能較完全地洗脫所要分離的成分，并力求用量少、洗脫時間短。

洗脫劑根據(jù)分離物中各成分的極性、溶解度和吸附劑的活性來選擇。91(4)操作

柱層析的設(shè)備主要有層析柱、部分收集器、磁力攪拌器和恒流泵。有條件時，配置一臺檢測儀和一臺記錄儀就構(gòu)成一個完整的層析系統(tǒng)。1.層析柱

層析柱是下端有細口并帶有篩板的玻管。柱的直徑與長度之比，一般為1∶10-1∶40。采用極細吸附劑裝柱時，宜用比例大的層析柱。反之，則宜用比例小的層析柱。這樣有利于節(jié)省時間和提高分辨率。層析柱的床體積是由吸附劑的量和膨脹度決定的。

(4)操作柱層析的設(shè)備主要有層析柱、部分收集器、磁922.吸附劑的用量

吸附劑的用量是根據(jù)其自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)決定的。當操作容量高時，吸附劑用量少。一般吸附劑的用量為被分離樣品的30-50倍。若樣品中各成分的性質(zhì)相似難以分開時，則吸附劑用量應(yīng)增大，有時大于樣品的100倍

2.吸附劑的用量933.裝柱裝柱的方法分干裝法和濕裝法兩種。干裝法系直接加吸附劑到柱中，然后倒入溶劑。此法不易將氣泡排盡。而濕裝法系先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用溶劑浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時打開柱下端口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。吸附劑表面要平整，應(yīng)使其一直浸沒在溶劑中，嚴防氣泡產(chǎn)生。3.裝柱94裝好的層析柱應(yīng)立即與洗脫劑連接，在一定的操作壓下(貯液器內(nèi)液面與層析柱出口之間的壓力差)，控制其流速，讓2-3倍柱體積的洗脫劑流過固定相，使其達到平衡，也使固定相高度恒定或離子強度與洗脫劑一致。裝好的層析柱應(yīng)立即與洗脫劑連接，在一定的操作壓下(貯液954.上樣和洗脫

經(jīng)過平衡的層析柱，當平衡液流到與固定相表面一致位置時，用滴管輕輕地把樣品溶液加到固定相表面，要盡量避免沖動基質(zhì)。加入樣品液的體積一般應(yīng)小于床體積的1/2(當加入的樣品量相同時，體積越小越有利于提高分辨率)。待樣品液的液面流到固定相表面時，用滴管加入洗脫劑(其體積用液面距固定相表面的高度約5厘米計)，并在柱上端與裝有洗脫劑的貯液瓶連接開始冼脫。同時在柱下端與部分收集器接通，立即進行分級收集(按體積或時間分管收集)。4.上樣和洗脫96隨后將收集的每管溶液進行濃度或活性測定。根據(jù)測定結(jié)果，即可繪制出洗脫曲線(以管號或洗脫體積為橫坐標，以每管溶液中樣品的濃度或活性為縱坐標，有合適的檢測器和記錄儀時，洗脫液流經(jīng)檢測器再收集，用記錄儀可自動繪制洗脫曲線。隨后將收集的每管溶液進行濃度或活性測定。97/v_show/id_XMTYxNTMzMTU2.html/v_show/id_X98理想的洗脫曲線如圖所示。圖中的峰均呈對稱形，二者沒有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開。層析峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。理想的洗脫曲線如圖所示。圖中的峰均呈對稱形，二者沒有99為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡過程不完全；如果太慢，洗脫物會擴散。若峰與峰之間有重疊，宜降低洗脫劑的強度，若峰間距離過大，或某些成分不能洗脫時，宜加大洗脫劑的強度(極性)，成分復(fù)雜時，可采用洗脫劑由弱到強的梯度洗脫(方法見離子交換層析)。

為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當控制。1004離子交換層析一、基本原理二、離子交換劑三、操作4離子交換層析一、基本原理101

離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(或功能基團)和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基團以共價鍵連接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA++B+RB++A+

一、基本原理離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進行的。此法廣泛應(yīng)用于很多生化物質(zhì)(例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機酸等)的分析、制備、純化，以及溶液的中和、脫色等方面。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(或功能基團)和反離子構(gòu)成102離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，它的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強酸性(陽性)離子交換劑對H+的結(jié)合力比對Na+的??；強堿性(陰性)離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對H+的結(jié)合力遠比對Na+的大；弱堿性離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的大。在應(yīng)用離子交換劑時，采用何種反離子進行電荷平衡是決定吸附容量的重要因子之一。離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，它的大小是由離子103離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。

離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間電荷相同時，水合離子半徑越小，結(jié)合力亦越大。離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中104有機混合物分離課件105氨基酸的分離過程氨基酸的分離過程106二、離子交換劑

離子交換劑應(yīng)滿足的基本條件有：

①有高度的不溶性。即在各種溶劑中不發(fā)生溶解；②有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進行自由擴散和交換；③有較多的交換基團；④有穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)。在使用過程中，不因物理或化學因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。

二、離子交換劑107(一)離子交換劑的種類

根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)，可將其分成兩大類：1.疏水性離子交換劑

疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂。常用的樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑，能把聚乙烯苯直鏈化合物連接成類似海綿狀的結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中以共價鍵引入不同的電荷基團。(一)離子交換劑的種類108離子交換樹脂以電荷基團的性質(zhì)分則有：陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂(分別包括強、中、弱三種電荷基團)螯合離子交換樹脂(對金屬離子有較強的選擇性)離子交換樹脂以電荷基團的性質(zhì)分則有：109(1)陽離子交換劑

陽離子交換劑的電荷基團帶負電，反離子帶正電。因此，可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進行交換反應(yīng)。根據(jù)電荷基團的強弱，又可將陽離子交換劑分為強酸型(帶磺酸基團)、中強酸型(帶磷酸基團或亞磷酸基團)和弱酸型(帶羧基的或酚基)三種。

(1)陽離子交換劑110(2)陰離子交換劑

陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺〔-N(CH3)3〕、叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔-NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基團構(gòu)成的。當引入季胺和叔胺基團時，分別為強陰性和中強陰性離子交換劑。當引入仲胺和伯胺基團時，為弱陰性離子交換劑。

(2)陰離子交換劑111疏水性的離子交換劑對帶電荷多和疏水性強的被分離物有較強的截留能力。陽離子交換樹脂對氨基酸的分離疏水性的離子交換劑對帶電荷多和疏水性強的被分離物有較強的截留1122.親水性離子交換劑

這類交換劑與水的親和力較大，載體孔徑大，適合于分離生物大分子，有多種類型：(1)纖維素離子交換型以纖維素為基質(zhì)，常用的功能基因有磷酸基(P.中強酸型)、磺酸乙基(SE，強酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，強堿型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱堿型)、氨基乙基(AE，中等堿型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等堿型)等，可制成纖維狀、微粒、短纖維、球形四種類型。

2.親水性離子交換劑113

(2)葡聚糖系離子交換劑以SephadexG25和G50為基質(zhì)，分別引入DEAE、QAE(二乙基(二羧丙基)氨基乙基，弱堿型)、CM、SP(磺丙基、強酸型)等功能基因，構(gòu)成8種交換劑，交換容量較離子交換纖維素大，除離子交換作用外，還有分子篩作用，但層析時床體積隨洗脫劑離子強度的增加而縮小，以SephadexG50為基質(zhì)的交換劑尤其明顯，為使用帶來不便。

(2)葡聚糖系離子交換劑114(二)離子交換劑的選擇

任何一種離子交換劑都不可能適用于分離所有的樣品。因此，選擇理想的離子交換劑是提高有效成分的收率和分辨率的一個重要環(huán)節(jié)。1.陰、陽離子交換劑的選擇

如果被分離物質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被分離物質(zhì)帶負電荷，則應(yīng)選擇陰離子交換劑；如果被分離物質(zhì)為兩性離子，要按照其穩(wěn)定狀態(tài)的凈電荷來選擇交換劑。

(二)離子交換劑的選擇1152.強、弱離子交換劑的選擇

強離子交換劑適用的pH范圍很廣。所以常用它來制備無離子水和分離一些在極端pH溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。

弱性離子交換劑適用的pH范圍較窄，在pH為中性的溶液中交換容量也高，用于分離生物大分子物質(zhì)時，其活性不易喪失。有機混合物分離課件1163.反離子的選擇

離子交換劑處于電中性時往往帶有一定的反離子。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。

強陽性和強陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。

3.反離子的選擇1174.基質(zhì)的選擇