生物大分子的分離純化和鑒定課件

生物大分子通常是指在生物體內(nèi)存在的或生物體代謝產(chǎn)生的具有特殊生物學(xué)功能的高分子化和物，主要包括蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖和脂類。生物材料的選擇與處理

一、選擇生物材料原則：有效成分含量高，穩(wěn)定，來源豐富，保持新鮮，提取工藝簡單，成本低。如：用酵母提RNA，用牛奶提酪蛋白，用大蒜提SOD(超氧化物歧化酶)二、生物材料處理：1、動物臟器：冰凍：-10℃冰庫（短期保存）

-70℃低溫冰箱（數(shù)月）干燥：可長期保存生物大分子通常是指在生物體內(nèi)存在的或生物體12、植物組織：10小時內(nèi)置-4-30℃冰箱儲藏備用3、微生物：胞外產(chǎn)物（如發(fā)酵液），低溫短時儲藏。

胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)收集菌體或細(xì)胞，制成凍干粉于4℃保存（數(shù)月不變質(zhì)）

除了體液和微生物胞外的某些蛋白質(zhì)和多肽以外,大多數(shù)生物大分子都存在于細(xì)胞之內(nèi).細(xì)胞破碎

1、酶學(xué)破碎法：外加酶制劑、自溶法。

2、機(jī)械破碎法：高速搗碎法、高速均漿法、高速磨珠法

3、物理破碎法：溫差法、壓差法、超聲波

4、化學(xué)破碎法：有機(jī)溶劑法、表面活性劑（SDS等）金屬螯合劑（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化學(xué)變性劑。2、植物組織：10小時內(nèi)置-4-30℃冰箱儲藏備用細(xì)胞破碎2蛋白質(zhì)的分離純化

依據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同（溶解度、電荷、相對分子質(zhì)量的大小，特異親和力等）確立的蛋白質(zhì)和酶的分離方法.其性質(zhì)包括:。

（1）利用溶解度差別的分離方法1、等電點沉淀：蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合液的PH值被調(diào)到其中某一種成分的PI時，該種成分蛋白質(zhì)將會沉淀下來，這種沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象（活性）能再溶解。高于或低于該PI的蛋白質(zhì)留在溶液。如：Glu的生產(chǎn)也是利用此性質(zhì)進(jìn)行的，GluPI3.22。蛋白質(zhì)的分離純化依據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同（溶解度32、鹽析

高濃度的鹽（常用硫酸銨）可以降低蛋白質(zhì)的溶解度。因為高濃度鹽爭奪了蛋白質(zhì)分子的水膜層，降低了環(huán)境中水的相對濃度，還中和了蛋白質(zhì)表面的電荷。不同蛋白質(zhì)因所帶電荷和水化程度不同而在不同的鹽濃度下分別沉淀出來。鹽的飽和度由低到高逐次增加，如血清中加入50%飽和度的(NH4)2SO4可使球蛋白析出，加入100%飽和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，達(dá)到分級分離的目的.

鹽析后必須脫鹽。

脫鹽最常見的方法是透析法，也可以用凝膠層析（葡聚糖凝膠SephadexG25脫鹽）、超過濾技術(shù)脫鹽。鹽析通常與等電點沉淀法相結(jié)合使用。脫鹽是否徹底，要經(jīng)常進(jìn)行檢查。如除去(NH4)2SO4可用10%BaCl2檢查；除去NaCl可用10%AgNO3檢查，直到透析液中檢測不出BaSO4或AgCl為止，透析完成。2、鹽析43、有機(jī)溶劑分級法

有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變介質(zhì)的介電常數(shù)，水是高介電常數(shù)（20℃時，80），有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì)（20℃時，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。這樣，蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭奪水化（膜）水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。

有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用。即操作時溶液的pH值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點附近。

3、有機(jī)溶劑分級法

有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要5（二）根據(jù)分子大小不同的分離方法：

1、透析和超過濾：即利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)（如無機(jī)鹽、單糖、水）等分開。（二）根據(jù)分子大小不同的分離方法：

1、透析和超過濾：62、密度梯度（區(qū)帶）離心：蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度介質(zhì)中離心時，每種蛋白質(zhì)顆粒降到與自身密度相近的密度梯度時停止不前，各種蛋白質(zhì)被分離成各自獨立的區(qū)帶。3、凝膠過濾（分子篩層析）根據(jù)分子大小來分離蛋白質(zhì)混合物的最有效的方法之一。當(dāng)分子大小不同的混和樣品通過裝填有高度水化的惰性多聚體（葡聚糖凝膠Sephadex和瓊脂糖凝膠Sepharose）的層析柱時，比凝膠“網(wǎng)眼”大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入“網(wǎng)眼”而被排阻在凝膠顆粒之外，比“網(wǎng)眼”小的分子則進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部。這樣，由于不同大小的分子所經(jīng)歷的路程不同而得以分離，大分子先洗下來，小分子后洗下來。2、密度梯度（區(qū)帶）離心：7生物大分子的分離純化和鑒定課件8（三）根據(jù)電荷不同的分離方法：

1、

電泳

2、

離子交換層析

（四）根據(jù)特異親和力不同的分離方法——親和層析（三）根據(jù)電荷不同的分離方法：9層析技術(shù)層析又稱色譜法：利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小，分子的極性，吸附力，分子的親和力，分子的分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相是固定的，稱固定相；另一相是流動的，稱流動相。當(dāng)流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達(dá)到分離。層析技術(shù)層析又稱色譜法：利用混合物中各組分的物理10（1）吸附層析：

利用吸附劑（固定相）表面對不同組分物理吸附性能的差異而達(dá)到分離的目的。如硅膠G薄層層析。（2）分配層析：利用各組分在給定的兩相中不同的分配系數(shù)而得到分離。如紙層析。（3）離子交換層析：利用離子交換劑與試樣中不同離子結(jié)合吸引力的差異大小不同而得到分離。常用的交換劑有CM—纖維素（弱酸型陽離子交換劑）。弱堿型的有陰離子交換劑DEAE—纖維素、改進(jìn)型的CM—Sephadex和DEAE—Sephadex。（4）凝膠層析：

利用固定相的孔徑對試劑樣各分子（分子量大小或體積大?。┑呐抛杼匦圆町愡M(jìn)行分離。（5）親和層析：

利用固定相特定配體與試樣各分子特異性結(jié)合力（親和力）大小不同進(jìn)行分離。（1）吸附層析：11電泳技術(shù)

電泳是指帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。原理：

在一定PH條件下，不同的物質(zhì)具有不同的等電點就帶不同性質(zhì)的電荷，因而在電場中它們的移動方向和移動速度也不同，可使它們分離。顆粒在電場中移動的速度主要決定于顆粒帶電荷的量，同時受顆粒形狀和顆粒相對分子質(zhì)量的大小的影響。電泳技術(shù)12目前，電泳（electrophoresis）方法大致可分為三類：顯微電泳、自由界面電泳（沒有支持物）及區(qū)帶電泳。以區(qū)帶電泳應(yīng)用比較廣泛。顯微電泳是用顯微鏡直接觀察細(xì)胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為的過程。目前已用于研究膜結(jié)構(gòu)及癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異性等方面。自由界面電泳是被分離的溶質(zhì)顆粒經(jīng)電泳后與緩沖溶液之間形成界面的電泳過程。利用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)可觀察到界面的移動。在電泳過程中，每個移動界面（峰）相當(dāng)于某一特定的蛋白質(zhì)。如：用于血漿蛋白成分的電泳。目前，電泳（electrophoresis）方法大致可13蛋白質(zhì)分離純化及鑒定分級沉淀法與等電點沉淀法聯(lián)合使用得到初步分離↓脫鹽（透析和凝膠過濾）↓離子交換層析或親和層析進(jìn)一步純化純化鑒定