基因工程載體

基因工程載體第1頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四章

基因工程載體vectors第2頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。一、載體

（Vectors）廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具叫載體。第3頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制原點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使得外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。（3）具有多種單一的核酸酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，可用于外源基因的插入，同時(shí)不影響載體的擴(kuò)增和繁殖。（4）具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測(cè)。（5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴(kuò)散，給人類造成危害2.基因工程對(duì)載體的要求第4頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第5頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.載體

的種類

基因工程中常用的載體有5類：

質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）

動(dòng)物病毒（virus）

來(lái)源第7頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月功能克隆載體:

克隆一個(gè)基因或DNA片段表達(dá)載體:

用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:

把一個(gè)基因插入到染色體組中第8頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。第9頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌的質(zhì)粒第10頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）分子?。?.質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1—500kb（2）編碼基因少：2—3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。（3）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質(zhì)?！笔荝NA,編碼毒性糖蛋白）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。第11頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型：①共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA第12頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③線形DNA（

linear，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。②開(kāi)環(huán)DNA（

opencircular，ocDNA）第13頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第14頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（6）氯化銫密度梯度離心提取質(zhì)粒超螺旋質(zhì)粒開(kāi)環(huán)和線性質(zhì)粒染色體DNA加入EB加入EB結(jié)合EB少結(jié)合EB多緊密密度高松散密度低密度梯度離心分離原理第15頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月氯化銫密度梯度離心法步驟：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過(guò)夜在紫外燈下注射器吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs過(guò)DowexAG50W-X8柱子，用數(shù)倍體積的TE/0.2mol/LNaCL清洗去除EB第16頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、質(zhì)粒的類型在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移1、依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分類第17頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。1.接合型質(zhì)粒：不符合基因工程的安全要求。第18頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌接合（conjunction）第19頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。第20頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月磺胺氨芐青霉素卡那霉素四環(huán)素鏈環(huán)素汞鹽抗性第21頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質(zhì)粒：大腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。第22頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、依據(jù)可否引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀分類顯性質(zhì)粒:宿主細(xì)胞由于含有質(zhì)粒而獲得新性狀隱蔽質(zhì)粒:宿主細(xì)胞含有此類質(zhì)粒而無(wú)異樣性狀隱蔽是因?yàn)槭軝z測(cè)的手段的限制，而不能觀測(cè)到新性狀第23頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A.嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。B.松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）拷貝數(shù)多，有10—60份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。3、依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類第24頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、質(zhì)粒的不親和性親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒，如野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒往往屬于不親和性質(zhì)粒。（攘外必先安內(nèi)）

不同質(zhì)粒有的可共存于同一細(xì)胞之中，但有的不行。把能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為親和性質(zhì)粒。相反不能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)粒或不相容性質(zhì)粒。第25頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）分子量大，拷貝數(shù)低四、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長(zhǎng)

9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。第26頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第27頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。第28頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ColE1第29頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來(lái)插入外源DNA片段。且插入后不影響復(fù)制功能。第30頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。第31頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本原則A、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。出發(fā)質(zhì)粒（也稱為親本質(zhì)粒）中應(yīng)含有克隆載體必備的元件，如復(fù)制起始原點(diǎn)、用于選擇標(biāo)記的基因、克隆位點(diǎn)B、獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。C、組裝合適的選擇標(biāo)記基因。D、構(gòu)建過(guò)程中，應(yīng)盡可能的刪除載體上不必要的DNA序列，以縮小質(zhì)粒的分子量，提高外源DNA的裝載量。E、構(gòu)建過(guò)程中，需要滅活出發(fā)質(zhì)粒上的某些編碼基因第32頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四環(huán)素抗性

（Tetr）鏈霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）4.質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：（1）選擇標(biāo)記①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：第33頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。a）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。第34頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過(guò)與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Cmlr

編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ睢）抑菌原理第35頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過(guò)與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Kanr

編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。第36頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過(guò)與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。第37頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理通過(guò)于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。Tetr編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。第38頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第39頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第40頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②

遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記其他標(biāo)記：如藍(lán)白斑篩選第41頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素第42頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。而且在沒(méi)有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000—3000個(gè)！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。第43頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來(lái)的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴(kuò)增DNA用。第44頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）失控的質(zhì)粒載體這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于35oC），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>35oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等構(gòu)建。第45頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）

插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無(wú)抗菌素抗性第46頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）正選擇的質(zhì)粒載體如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Directselectionvectors第47頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindⅢKil基因Pkn80（17kb）PKN80質(zhì)粒帶有來(lái)自Mu噬菌體DNA的EcoRI-C片段，它編碼一種kil基因，使Mu噬菌體非溶源菌株致死。HindIII位點(diǎn)上插入外源DNAHindIII位點(diǎn)無(wú)插入外源DNAKil基因無(wú)活性Kil基因有活性Mu噬菌體非溶源菌株致死Mu噬菌體非溶源菌株存活第48頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（6）

表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號(hào)控制之下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。第49頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動(dòng)基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件①表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)第50頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用質(zhì)粒載體將真核生物基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),該質(zhì)粒載體應(yīng)具備哪些元件?1）普通載體元件復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動(dòng)基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。第51頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第52頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1.pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長(zhǎng)度9.09kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr第53頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個(gè)位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)第54頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第55頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度6.3kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多！第56頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①colicinE1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③

不被其他細(xì)菌的colicinE1所殺死的原因imm基因第57頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點(diǎn)ColicinE1外源DNA無(wú)Colicin第58頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用對(duì)外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。對(duì)colicinE1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicinE1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗colicinE1殺ColE1-仍抗colicinE1不殺ColE1-插入片段ColE1第59頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第60頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件來(lái)源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。①?gòu)?fù)制起點(diǎn)

oripMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。第61頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）長(zhǎng)度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。第62頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第63頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記

插入失活，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。第64頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡第65頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。③

高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過(guò)程中容易段裂。第66頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。（6）pBR322的缺點(diǎn)能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！第67頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①刪除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片段，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進(jìn)第68頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pBR325：在pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICm的HaeII酶切片段（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。使EcoRI也成為插入失活型位點(diǎn)。②

改造EcoRI位點(diǎn)第69頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19第70頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①

復(fù)制起點(diǎn)pBR322的

ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。②

Ampr基因（1）元件來(lái)源③lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌④lacZ’基因大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，

是LacZ的氨基端片段。pBR322的Ampr基因第71頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）長(zhǎng)度約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。第72頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第73頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ampicillin抗性和lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（4）選擇標(biāo)記藍(lán)白斑選擇原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）第74頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月-半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)-半乳糖苷酶②-半乳糖苷酶Xgal顯色反應(yīng)：第75頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③lacZ的肽互補(bǔ)1）-肽（

lacZ’

）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體第76頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）受體菌lacZ突變受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解Xgal。受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a。第77頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pUC質(zhì)粒載體上的lacZ’

編碼肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體。又能分解Xgal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’

受體菌lacZ?3）載體lacZ’與互補(bǔ)第78頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4）互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ’的5’端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ’的合成。不能互補(bǔ)。lacZ’

5’

3’

肽移碼突變lacZ’

5’

3’

肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNA第79頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月④IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽！IPTG第80頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：第81頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)質(zhì)粒的受體菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無(wú)抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌斑生長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物互補(bǔ)，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長(zhǎng)帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長(zhǎng)第82頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第83頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn)①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測(cè)序方便第84頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測(cè)序。M13mp18的多克隆位點(diǎn)pUC18的多克隆位點(diǎn)第85頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、其它質(zhì)粒載體1.pGEM-3Z由pUC派生而來(lái)。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6。T7啟動(dòng)子SP6啟動(dòng)子MCSlacZ’

Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。第86頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①

如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA②外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。③MCS與pUC18的完全一樣。2.pGEM-4Z：與pGEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換。pGEM-3Z的特點(diǎn)：第87頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.穿梭質(zhì)粒載體（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttleplasmidvectors）第88頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Yeast復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體第89頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)②也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。③可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因?？寺　?gòu)建表達(dá)E.coliAnimalcell①

利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)第90頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、TA克隆載體原理：Taq酶特點(diǎn)研制出了一種線形質(zhì)粒，其3’端各帶一個(gè)不配對(duì)脫氧胸腺嘧啶核苷（T），采用該質(zhì)?？蓪CR產(chǎn)物以TA連接的方式直接進(jìn)行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體被稱為T(mén)A克隆載體。第91頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第92頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Tvector的克隆過(guò)程——簡(jiǎn)便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA第93頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月環(huán)化的質(zhì)?？寺≥d體

TA克隆載體

姜穎等人于2000年提出了一般質(zhì)?？寺≥d體改造成TA克隆載體的方法。第94頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）克隆載體線性化。限制性核酸內(nèi)切酶酚/氯仿抽提乙醇沉淀10000r/min5min離心雙蒸水溶解第95頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng)。雙蒸水溶解加入dNTP(5mmol/L)0.8μlKlenow緩沖液2μlKlenow酶1μl加水補(bǔ)齊至20μl37°C溫育3h酚/氯仿抽提乙醇沉淀4℃以10000r/min離心5min雙蒸水溶解第96頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）克隆載體末端加T反應(yīng)。雙蒸水溶解MgCl2(25mmol/L)3μll,Taq酶緩沖液5μldTTP(20mmol/L)2.5μlTapDNA聚合酶1μl加水至50μl75℃溫育2h酚/氯仿抽提乙醇沉淀4℃以10000r/min離心5min雙蒸水溶解第97頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月注意:改造后的克隆載體與PCR產(chǎn)物連接后，將克隆載體線性化的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)外的序列已經(jīng)改變，不能再為該酶所識(shí)別。如果用產(chǎn)生平末端的限制性核酸內(nèi)切酶消化環(huán)形質(zhì)粒，即可不必經(jīng)過(guò)Klenow酶的補(bǔ)平反應(yīng)。第98頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性1.質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分

配到兩個(gè)子細(xì)胞中。第99頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說(shuō)。（1）主動(dòng)分配天然質(zhì)粒。2.質(zhì)粒分配方式具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。第100頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機(jī)分配但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。第101頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)?？截?，并最終繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。3.分離的不穩(wěn)定性（segregationinstability）第102頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structuralinstability）寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。ISdimer重組第103頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）新陳代謝負(fù)荷：5.影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長(zhǎng)約15%。①?gòu)?fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。②轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！第104頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（variance）：是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。第105頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。（3）寄主菌的重組體系二聚體災(zāi)難（dimercatastrophe）：含有大分子量插入片段的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。第106頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

噬菌體載體

噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。一、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。第107頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月singlelinearDNA(about182,000bp)T2GenomicDNA第108頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月T4Bacteriophage護(hù)套第109頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分為兩種：1.溶菌周期：二、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（virulentphage)第110頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第111頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第112頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.溶原周期：感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱為溶源化（lysogenization)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（temperatephage)原噬菌體（prophage)：第113頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第114頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、單鏈?zhǔn)删w載體

M13、f1、fd噬菌體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13噬菌體第115頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。1.單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn)（3）RFDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)

大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片

段的單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。第116頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.M13噬菌體RFdsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。但M13DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407bp。（2）DNA長(zhǎng)度（3）DNA提純（1）寄主第117頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13序列第118頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）M13的生活周期雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，約為正常的1/2—3/4）M13通過(guò)雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA－DNA轉(zhuǎn)錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞第119頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯+DNA指導(dǎo)合成+DNA200個(gè)RFDNA每個(gè)細(xì)胞可以放出約1000個(gè)M13顆粒！第120頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13噬菌體包裝DNA分子的能力可達(dá)M13DNA長(zhǎng)度的6倍。（5）沒(méi)有包裝限制第121頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.M13載體的構(gòu)建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定①基因間隔區(qū)（intergenicregion,IG區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè)BsuI切點(diǎn)。其余9個(gè)BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。②酶切位點(diǎn)第122頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13J.Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。第123頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ’（-肽序列)。利用-肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（BglII、AvaII和PvuI）。（2）加入酶切位點(diǎn)①

在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn)第一個(gè)M13載體：M13mp1：第124頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13RFBsuI不完全消化各種長(zhǎng)度的線性片段（其中應(yīng)有只在IG上切開(kāi)的線性全長(zhǎng)M13）E.coli

lac基因的HindII片段(lacI、lacP、lacO、lacZ’）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區(qū)插入lacZ’才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑第125頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）M13載體系列加上常用的酶切位點(diǎn)。①M(fèi)13載體系列的命名M13mpnn代表系列數(shù)字②

對(duì)M13mp1的改進(jìn)B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ’5’端的第16個(gè)核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個(gè)EcoRI切點(diǎn)。M13mp2：第126頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5’ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亞硝基脲

把G甲基化

5’ATGACCATGATTACGGATTCA-轉(zhuǎn)染E.coli。mG與T配對(duì)，復(fù)制兩次后5’ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點(diǎn)用EcoRI切M13mp1M13mp2選擇能切開(kāi)的

線性分子再環(huán)化M13mp1第127頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③

對(duì)M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn)在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對(duì)應(yīng)有相同MCS的pUC系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為M13mp系列載體：第128頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第129頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月12第130頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月與pUC18相同M13mp18的多克隆位點(diǎn)第131頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇（3）無(wú)包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。第132頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MCS+-+-+-編碼鏈非編碼鏈外源DNA不同的酶切不同的酶切插入M13vector第133頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13RF+-+-+-外源DNA轉(zhuǎn)染E.coli成熟的子代M13中++第134頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①

插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降②實(shí)際克隆能力小于1500bp。雖無(wú)包裝限制，并非無(wú)限包裝！5.M13載體的缺點(diǎn)第135頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.噬菌粒載體（phagemidvectors）由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。MCS噬菌體ori質(zhì)粒oriAmprlacZ’

lacI第136頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月約3000bp（比M13?。诳寺∧芰Υ竽懿迦?0kb的外源DNA。③兩種復(fù)制形式①分子量?。?）噬菌粒載體的特點(diǎn)既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。第137頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）常見(jiàn)的噬菌粒載體噬菌粒載體質(zhì)粒部分單鏈?zhǔn)删w部分輔助噬菌體大腸桿菌寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101VXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue輔助噬菌體用來(lái)復(fù)制和包裝噬菌粒載體。第138頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）pUC118/pUC119①構(gòu)成1）M13的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：帶有M13復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)Ampr

lacZ’

MCS第139頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MCSpUC18/pUC19oriAmprlacZ’

lacIM13ori3.2kbpUC118/119第140頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②pUC118/119的復(fù)制模式兩種不同的復(fù)制模式1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式受pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)（來(lái)源于ColE1）的控制。每個(gè)細(xì)胞能達(dá)到500個(gè)拷貝。第141頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月來(lái)源于M13的復(fù)制起點(diǎn)被輔助噬菌體的基因II產(chǎn)物控制。2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式外殼蛋白復(fù)制蛋白輔助M13包裝當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體M13感染后。第142頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③噬菌粒載體的包裝1）輔助噬菌體：自身的復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。如M13K07等。2）包裝：輔助噬菌體外殼蛋白和復(fù)制蛋白噬菌粒載體ssDNA噬菌體第143頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）pBluescript噬菌粒載體（pBS）Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7噬菌體的啟動(dòng)子組成。②特點(diǎn)①組成MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。1）定向體外轉(zhuǎn)錄第144頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）兩種復(fù)制模式既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。3）選擇方便有Ampr和lacZ’，可以進(jìn)行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇。4）插入方便18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的MCS第145頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SK：表示lacZ’的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的

SacI

KpnI

+（f1+）：?jiǎn)捂湉?fù)制起始方向背離

lacZ’，能回收l(shuí)acZ’的編碼鏈（+）pBluescriptSK（+/-）/pBluescriptKS（+/-）KS：反向（

KpnI

SacI，MCS相反）-（f1-）：能回收l(shuí)acZ’的非編碼鏈（-）1）pBluescriptSK/KS（+/-）區(qū)分：③

常用的pBluescript載體第146頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pBSSK+第147頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pBSKS-第148頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）噬菌粒T載體pCR系列載體Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的線性噬菌粒載體。①結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、f1噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已經(jīng)切開(kāi)，各有一個(gè)3’端突出的T。②特點(diǎn)PCR產(chǎn)物往往在3’端突出一個(gè)A，所以能與這個(gè)載體直接連接。第149頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pCR2.1第150頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pCR2.1的MCS克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的EcoRI切下來(lái)回收。第151頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Promega公司

T載體系列pGEM-TvectorpGEM-TEasyvector第152頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pTargetvectorG418抗性可在真核生物表達(dá)

pTARGETTM

載體包含巨細(xì)胞病毒CMV早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，可啟動(dòng)基因在多種細(xì)胞中高水平表達(dá)。這個(gè)載體還包含一個(gè)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Neo)，可用抗生素G-418篩選細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株。Promega公司

T載體系列第153頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7.噬菌體展示載體（

Phagedisplayvector）（1）噬菌體展示（Phagedisplay）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。G.P.Smith1985年發(fā)明。絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的一端，有3-5個(gè)基因Ⅲ編碼的蛋白質(zhì)（g3p），在識(shí)別和吸附大腸桿菌的過(guò)程中起作用。第154頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13第155頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）噬菌體展示載體的構(gòu)建把外源DNA片段插入基因Ⅲ的序列前端，并保持兩者的閱讀框正確，表達(dá)出融合蛋白。啟動(dòng)子外源DNAM13基因ⅢoriM13displayvector外源多肽第156頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、雙鏈?zhǔn)删w載體—載體（1）長(zhǎng)度為48502bp；（2）雙鏈線性DNA；（3）但在兩端有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。1.DNA分子的特點(diǎn)

cos位點(diǎn)（cohensive-endsite）：第157頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RFDNA）。第158頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體和其DNA第159頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA上有至少61個(gè)基因，有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列。其他約1/3是非必須基因（位于尾部合成至阻遏蛋白基因之間的區(qū)段）。2.噬菌體的基因組特點(diǎn)

第160頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月genome(48502bp)第161頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行型復(fù)制。3.DNA的復(fù)制模型（1）

型復(fù)制第162頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）滾環(huán)復(fù)制

感染的晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。形成多聯(lián)體DAN分子。第163頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月滾環(huán)復(fù)制第164頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月這種多聯(lián)體分子必須在cos位點(diǎn)被切斷成單體分子才能被包裝起來(lái)。第165頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）構(gòu)建原理：4.噬菌體載體的構(gòu)建（2）構(gòu)建過(guò)程①在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn)②引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記③突變某些基因，使它成為安全載體④刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn)噬菌體DNA上本身有5個(gè)EcoRI和7個(gè)HindIII切點(diǎn)！刪除噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。第166頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）人工構(gòu)建的噬菌體載體有兩種類型：①插入型載體（insertionvectors)：如

gt10、gt11、BV2、NM540、NM1590、NM6071）免疫功能失活型：插入位點(diǎn)位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi)。EcoRIcIgt10第167頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，載體DNA不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。沒(méi)有外源DNA插入的載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。選擇標(biāo)記:如NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因內(nèi)部。第168頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）-半乳糖苷酶失活型載體：在基因組中引入了LacZ’序列。（其上含有一個(gè)EcoRI克隆位點(diǎn)）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利用Xgal的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。LacZ’

EcoRICharon16A選擇標(biāo)記:第169頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②

替換型載體（substitutionvectors)

兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于DNA的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用同樣酶切成的外源DNA片段置換?？芍脫Q區(qū)MCSMCS如：

EMBL4、Charon40等。13第170頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）EMBL4EMBL4的可置換片段內(nèi)部還有SalI酶切位點(diǎn)。以便于進(jìn)一步消化中間片段，防止自我連接。左臂可置換區(qū)右臂EcoRIBamHISalISalIBamHIEcoRISalISalIEMBL4第171頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）Charon40Charon40的可置換片段是由DNA短片重復(fù)構(gòu)成，片段之間有HaeI切點(diǎn)。在克隆的時(shí)候，可以用HaeI酶進(jìn)一步將可置換片段切成小片段，以防止重新與載體連接。左臂可置換區(qū)右臂MCSMCSCharon40HaeI第172頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月可取代片段中如果包含LacZ’，可用Xgal顯色作篩選標(biāo)記。（4）載體的篩選標(biāo)記②插入型載體根據(jù)插入所引起的表型突變。①置換型載體第173頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體克隆策略置換型載體第174頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。5.載體的體外包裝

在試管中與噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中。必須利用噬菌體外殼的作用?。?）體外包裝：第175頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第176頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與DNA進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。（2）體外包裝過(guò)程①噬菌體外殼蛋白的合成E基因的E基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因第177頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月E基因突變只合成尾部蛋白和包裝識(shí)別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白和包裝識(shí)別蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的載體DNA體外包裝成活性噬菌體第178頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月外源的重組DNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原DNA發(fā)生重組。（3）體外包裝存在的問(wèn)題：①包裝錯(cuò)誤：既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的內(nèi)源性原DNA，也能包裝重組的DNA載體。②重組：第179頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%—105%（36—51kb）之間。既不能超過(guò)正常野生型容量的5%；又不能低于正常野生型容量的75%野生型DNA的必須區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。（實(shí)際上為15kb）。第180頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。（4）DNA載體的優(yōu)點(diǎn)用在真核生物基因組文庫(kù)的建立。Sau3ABamHI第181頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第182頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑第183頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1978年J.Collins和B.Hohn等人發(fā)展出cosmidvector（cossite-carryingplasmid)DNA：4—6kb（1）大小

（2）組成

6.cosmid載體（粘粒）cos序列和控制包裝的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子抗藥性基因幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)第184頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pHC79第185頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①具有噬菌體的特性：（3）cosmidvector的特點(diǎn)

克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌

）。②具有質(zhì)粒載體的特性：大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。第186頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。③方便的選擇：④高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。第187頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）部分cosmidvectorCosmid載體復(fù)制子大?。╧b)選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)克隆能力（kb)c2XBpMB16.8Ampr,Kanr

BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,PstI,SmaI32~45pHC79pMB16.4Ampr,Tetr

EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,PstI,CalI29~46pHS262ColE12.8Kanr

BamHI,EcoRI,HincII34~50pJC74ColE115.8Ampr

EcoRI,BamHI,BglII,SalI21~37pJC75-58ColE111.4AmprEcoRI,BamHI,BglII16~42pJC74mColE121Ampr,KanrBamHI16~32pJC720ColE17.1Elimm,Rifr

HindIII,XmaI11~28第188頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Cosmid載體復(fù)制子大小（kb)選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)克隆能力（kb)pJC81pMB17.1Ampr,TetrKpnI,BamHI,HindIII,SalI30~46pJB8ColE15.4Ampr

BamHI,HindIII,SalI31~47MuA-3pMB14.8TetrPstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuII32~48MuA-10pMB14.8TetrEcoRI,BalI,PvuI,PvuI32~48pTL5pMB15.6TetrBglII,BalI,HpaI31~47pMF7pMB15.4Ampr

EcoRI,SalI32~48第189頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”（cosmidcloning）。（5）cosmidcloning①理論依據(jù)：cos位點(diǎn):噬菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)DNA通過(guò)cos位點(diǎn)連接的“多聯(lián)體”分子?！岸嗦?lián)體”復(fù)制：包裝識(shí)別。第190頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在包裝的時(shí)候，

噬菌體具有位點(diǎn)特異的末端酶（terminase）體系（Ter體系），識(shí)別cos位點(diǎn)，把多聯(lián)體切成單個(gè)DNA長(zhǎng)度。兩個(gè)cos位點(diǎn)之間，必須保持38—45kb的DNA，Ter體系才能識(shí)別。野生型噬菌體DNA的75％——105％。Ter體系：包裝限制：第191頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物DNA。（6）cosmid克隆的一般過(guò)程②用同樣的內(nèi)切酶消化cosmid載體。產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個(gè)cos位點(diǎn)、長(zhǎng)度40kb左右的真核DNA與載體的連接物。③連接第192頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月切割合適長(zhǎng)度的雜種DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種DNA分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制。⑤感染大腸桿菌④Ter體系識(shí)別并切割第193頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第194頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第195頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第196頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大質(zhì)粒！第197頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①載體片段自我連接。②外源DNA片段自我連接。③多個(gè)本來(lái)不在一起的外源DNA片段連接起來(lái)同時(shí)插入載體。（7）cosmid載體克隆的缺點(diǎn)用堿性磷酸酶除去線性質(zhì)粒片段5’端的磷酸，可防止載體自體連接?？朔d體自體連接的改良方案：第198頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①I(mǎi)sh-Horowice—Burke改良方案1981年，D.Ish-Horowice和J.F.Burke。（8）cosmid載體的改良在BamHI位點(diǎn)兩側(cè)各有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)。1）突出的特點(diǎn)：pJB8cosmid載體使克隆在BamHI上的外源DNA可被EcoRI切下來(lái)。第199頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月包裝識(shí)別第200頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）Ish-Horowice—Burke方案克隆過(guò)程第201頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月a.需要脫磷酸化處理。b.電泳純化載體兩臂。c.載體兩臂的最終得率少的可憐！2）Ish-Horowice—Burke方案的缺點(diǎn)防止載體自我連接第二次酶切后。第202頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1983年P(guān).F.Bates和R.A.Swift②Bates---Swift改良方案a.具有兩個(gè)cos位點(diǎn)。SmaI平端的連接效率低，阻止了載體臂的自我連接，增加了外源DNA的連接效率。1）特點(diǎn)：b.一個(gè)SmaI切點(diǎn)把兩個(gè)cos位點(diǎn)分開(kāi)。c.BamHI克隆位點(diǎn)。c2XBcosmid載體第203頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第204頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Bates---Swift克隆過(guò)程：第205頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

大分子DNA克隆載體A.W.Murray1983年形成基礎(chǔ)理論,D.T.Burke等1987年變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。一、酵母人工染色體1.YAC的特點(diǎn)：（1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。（yeastartificialchromosome,YAC)（2）克隆容量大，為230kb-1700kb。（3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。第206頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ori）2.染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：TELTELCENORI（2）著絲粒（centromere，cen）（3）兩個(gè)端粒（telomeres，tel）第207頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月LeuARSCENLeu-Yeast后代死Leu-Yeast80%后代死Leu-Yeast后代活Leu-Yeast后代死Leu-Yeast后代活TelTel第208頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）著絲粒區(qū)（CEN）A

AGTCACGTGTTGTTTCTGNTTTCCGAAA3.YAC的組成結(jié)構(gòu)酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:78-86bpIIIIII由三個(gè)區(qū)組成第209頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酵母第3、4、6、11號(hào)染色體的著絲粒區(qū)序列：第210頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI）約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）人是TTAGGG重復(fù)序列;四膜蟲(chóng)是GGGTTG重復(fù)序列。（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個(gè)端粒序列Tel。第211頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月位于

SUP4

基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。第212頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Sup4基因編碼赭色抑制tRNATYR(酪氨酸)，抑制赭色表型(成為白色)。

不含外源DNA片段的YAC載體轉(zhuǎn)化酵母菌，轉(zhuǎn)化子的菌落呈白色。

插入的外源DNA片段的YAC重組載體，其Sup4已經(jīng)失活，結(jié)果轉(zhuǎn)化酵母菌后所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子形成赭色菌落。第213頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TRP1、URA3（分別位于兩臂）細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)

ori和抗生素標(biāo)記Ampr

（5）在酵母中的標(biāo)記基因（6）在細(xì)菌中操作色氨酸尿嘧啶第214頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.YAC克隆外源DNAURA3TRP1CEN4第215頁(yè)，課件共244頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）宿主酵母菌：

只有同時(shí)得到Y(jié)AC的兩個(gè)臂，才能在基本培養(yǎng)基（不加TRP和URA）上生長(zhǎng)。（2）選擇方式5.YAC轉(zhuǎn)化過(guò)程trp-

和

ura-