單克隆抗體制備方案

10單克隆抗體制備方案細胞融合前預(yù)備一、動物免疫動物Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠齡8周左右。為避開3～4只小鼠。免疫原制備15ml15個、50ml7個、10ml5支、Tip20個、電子天平、CFA、PBS、CFA〔使用前需震搖〕50μg/80mg10mlPBS中，充分混勻。取1ml7mlPBS中，50ml10mlCFA用注射器反復(fù)推吸。取一滴參加水中，假設(shè)不馬上散開，則乳化好。4℃保存。80mg10mlPBS1ml3mlPBS中，1ml9mlPBS50ml10mlCFA用注射器反復(fù)推吸。取一滴參加水中，假設(shè)不馬上散開，則乳化好。4℃保存。90mg10mlPBS1ml2mlPBS中，1ml9mlPBS50ml10mlCFA用注射器反復(fù)推吸。取一滴參加水中，假設(shè)不馬上散開，則乳化好。4℃保存。80mg10mlPBS1ml1mlPBS中，1ml9mlPBS50ml10mlCFA用注射器反復(fù)推吸。取一滴參加水中，假設(shè)不馬上散開，則乳化好。4℃保存。100mg10mlPBS1ml1mlPBS50ml10mlCFA于該離心管中。反復(fù)搖擺，用注射器反復(fù)推吸。取一滴參加水中，假設(shè)不馬上散開，則乳化好。4℃保存。試驗步驟1ml，0.2ml/點，3只承受腹腔注射〕3周后其次次免疫：與初次免疫等量的抗原溶液加等體積加福氏不完全佐劑IF下注射3周后第三次免疫：與初次免疫等量的抗原溶液加等體積加IFA，腹腔和皮下注射，5天后內(nèi)眥靜脈或斷尾取血以ELISA間接法測效價2～3周后加強免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，靜脈或脾內(nèi)緩慢注射，以免動物發(fā)生過敏性休克而死亡。腹腔注射

3～4天后取脾細胞融合將鼠固定在手掌間，必要時，以左手無名指及小指夾住鼠尾；右手持連有5號針頭的注射器，將針頭從下腹部朝頭方向刺入腹腔，回抽無回血或尿液，表示針頭未刺入肝、膀胱等臟器，即可進展注射。進展腹腔注射時應(yīng)留意：1、針頭刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破內(nèi)臟。2、針頭與腹腔的角度不宜太小，否則簡潔刺入皮下。3、用的針頭不要太粗，以免藥液注射后從注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。、為避開注射后藥液從針孔流出，也可在注射時先使針頭在皮下向前推一小段距離，然后再刺入腹腔。皮下注射右手持注射器將針頭刺入，固定后即進展注射。一般狗、貓多在大腿外側(cè)；豚鼠在后大腿內(nèi)側(cè)或小腹部；大鼠可在側(cè)下腹部。兔在背部或耳根部注射。留意事項上增加。1:1。說明未乳化好。ELISA間接法、免疫雙集中法、環(huán)狀試驗等。用雙向免疫ELISA后可用于融合。皮下注射給藥住進針部位片刻，以防止藥物外漏。二、脾淋巴細胞試劑4g100ml，40.1mol/LPBS0.4％w/v1ml4%9ml0.1mol/LPBS。RPMI-1640培育液10%FCS-1640培育液試驗步驟①加強免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗體檢測時的陽性比照。試管靜置30～60min后，將血塊輕輕剝離管壁，3000r/min15～20min，吸取上清〔血清〕4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?51min菌條件下取出脾臟置于盛有10ml不完全RPMI-1640培育液的平皿中，輕輕洗去脾臟上的紅細胞并細心剝?nèi)ニ闹芙Y(jié)締組織，于盛有10ml的RPMI-1640培育液的無菌平皿中過不銹鋼篩網(wǎng)用注射器針芯研磨脾臟后用玻璃吸管吹打數(shù)次制成細胞懸液，10ml離心管中。50ml離心管中⑤以RMPI-164050ml1000r/min10min，棄上清10mlRPMI-1640培育液重懸⑦重復(fù)⑤⑥步驟⑧計數(shù)活細胞：把細胞懸液稀釋到約106個/ml，將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋0.9ml細胞懸液和0.1ml濃度0.4％的臺盼藍工作液于EP管中，充分混勻中靜置1～2min，不超過5min。假設(shè)染色時間太久，細胞將下沉或受損，而且局部活細胞也會著色。用加樣器留神混勻細胞懸液后，馬上用微量加樣器將其加于血球計數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀看并計數(shù)活細胞和死細胞。死細胞被80%為合格。留意事項①取樣計數(shù)前應(yīng)充分混勻細胞懸液。②數(shù)細胞的原則是只計數(shù)完整的細胞，鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，假設(shè)細胞團占10%以上，說明分散不好，需重制備細胞懸液。假設(shè)細胞壓在格線上時，只計上側(cè)和左方的。③操作時留意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重計數(shù)。22×108左右。三、飼養(yǎng)細胞①10～12Balb/c753min～5minFCS-1640培育液注射到小鼠腹腔〔嚴(yán)禁刺破腸管〕3min～5min后，用無菌剪刀剪開小鼠腹部一小口，用圓頭尖吸50ml離心管中。吸的過程肯定不要刺破腸管以免細菌污染。1200r/min5min～6min10%胎牛血清〔FCS〕1×105個/ml96100μl37℃CO2培育箱中培育.四、骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞介紹細胞株。骨髓瘤細胞適合于一般的培育液，如RPMI1640，DMEM培育基。細胞的最大密度106個/ml1∶103～5天傳代一次。細胞的倍增16～20SP2/0細胞為懸浮或稍微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。在細胞融合的前一天用穎的10%F2.0×105個/ml1×107～6×107對數(shù)生長期〔即15h～20h〕的骨髓瘤細胞，于室溫1000g〔3000r/min〕離心10min收集沉淀，以無個/ml。經(jīng)胎盼藍染色活細胞數(shù)>95%。SP2/0細胞是腫瘤細胞株，一般注射到小鼠體內(nèi)約1周左右就可以使小鼠致死。在其狀態(tài)萎靡的時候就可以用根底培育基洗出其腹腔中的細胞，分別SP2/0細胞。整個過程要保證無菌，否則就前功盡棄了。為了防止骨髓瘤細胞〔HGPRT缺陷株〕變異消滅返祖現(xiàn)15μg/ml20μg/ml8－氮鳥嘌呤(8-AG)的培育1～2周即可用于8-AG一般試劑公司都有〔Sigm8-AG。細胞培育徹底消毒。30～60min，試驗做完后再用紫外燈照耀紫外線燈，關(guān)后格外鐘即可進入。10～30min，然后讓超凈工作臺預(yù)工作10min～15min，以除去臭氧和使工作臺面空間呈凈化狀態(tài)。75%0.2%潔爾滅消毒手和用消毒液洗手。75%區(qū)域操作。CO2鋼瓶的壓力、CO2培育箱中CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染〔水盤的水用無菌水，每周更換?！睬胁恍杏镁凭潦糜袡C玻璃擋板。過的玻璃器皿30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液10-153-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。細胞要常常凍存，只要細胞狀態(tài)好就將細胞凍存起來。,圓形光明,排列整齊,0.1×個/ml90%～95%。細胞傳代0.25胰蛋白酶〔25cm22ml，75c2胰蛋白酶參加100mlD-hanks液中，濾膜過濾除菌，分裝4℃保存。使用時溫度在37℃左右為宜。5ml吸管、Tip頭、加樣器、培育瓶細胞凍存試驗器材及試劑RPMI-16406.8ml2ml，DMSO1.00.1ml，5.6%NaHCO30.1ml。NaHCO3可在超凈臺內(nèi)經(jīng)過濾膜除菌。DMSO在常溫下有毒，在配置凍存液時，留意保護自己，帶好手套。最好現(xiàn)配現(xiàn)用。顯微鏡、-80℃冰箱、紗布試驗步驟一次培育液。800～1000r/min5mi〔1000r/mi5min3～5min太短達不到預(yù)期效果。1×106個/ml～1016個/ml〔5106個/ml。1～1.5ml?？捎媚z帶密封。每個凍存管上標(biāo)明凍存時間、細胞名稱、操作者等。此外還應(yīng)記錄每個凍存管中的細胞數(shù)量。430min。-2030min。⑦將細胞轉(zhuǎn)移至-80℃16～18小時〔或隔夜。留意

⑧最終勻速下降至液氮中。1h，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細胞大量死亡。②原則上細胞在液氮中可儲存多年，但為妥當(dāng)起見，凍存11次，然后再連續(xù)凍存。DMSO430～60min后使用。細胞生長曲線MTT比色試驗檢測原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT復(fù)原為不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲臜，用酶490nm波特長測定其吸光度值，可間接反映活細胞的數(shù)量。MTT比色法計數(shù)為A質(zhì)計算出細胞數(shù)。試劑及試驗器材pH7.4〕在電磁攪拌機上攪拌30min，用0.22 m的微孔濾膜除菌，分裝，4℃保存，兩周內(nèi)有效。保存在-20度長期保存，避開反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。RPMI-1640培育液、0.25%胰蛋白酶消化液、DMSO、96孔培育板、10lTip頭、酶標(biāo)儀、振蕩混合器、顯微鏡、離心管制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：預(yù)備細胞懸液，從1×107個/200l/孔開頭在96孔平板中倍比稀釋至102個/200l/3374h后細胞貼壁，每孔中參加20lMTT4h～6h，終止培育，對于懸浮生長的細胞，需離心〔1000r/min，5min150lDMSO10min，使甲臜充分溶解。度值。制作生長曲線：調(diào)整細胞的濃度，按2×103個/200l/孔接種在9610塊203712hMTT比色法測定一塊板中細〔A〕為縱軸繪制出細胞的生長曲線。留意10%胎牛血清的培育液進展試驗。呈色后盡量吸凈培育孔的培育液。細胞計數(shù)法細胞培育瓶30個、臺盼藍、計數(shù)器、顯微鏡、計數(shù)板、蓋玻片104/ml7ml，12h用臺盼藍計數(shù)其中的細胞數(shù)。SP2/0雖為半懸浮生長，但懸浮細胞多為死細胞2～3天可吸掉培育液并參加等體積的培育液。吹打前用右手緊握培育瓶使其平放在手心，右手從右側(cè)拍擊培育瓶壁4～5次，不要讓培育瓶晃動猛烈而形成泡沫。細胞復(fù)蘇40℃并等到溫度到達再開頭復(fù)蘇過程、15ml離心管、RPMI-164010%1640培育液、CO2培育箱、Tip頭、低速離心機3720min，備用。37℃水浴中，快速搖擺，直至凍存液完全溶化。15ml10〔1000r/min5mi。105個/ml，CO2培育箱中培育。⑤記錄復(fù)蘇日期。⑥次日更換培育液，連續(xù)培育【留意事項】氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。DMSO對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，1-2min內(nèi)使凍存液完全溶化。假設(shè)復(fù)蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷。DMSO最好選擇進口產(chǎn)品。DMSO濃度較高，留意參加少量培育液可稀釋其濃度，以削減對細胞的損傷。1％。所以1010ml以上的培育基就恰好稀釋到了無害濃度。五、細胞融合，選擇雜交瘤用作細胞融合劑的聚乙二醇〔PEG〕4000者，該分子量的PEG呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他很多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，與很多化學(xué)。通常選用供氣相色譜用的高純度PEG做融合劑。SP2/0細胞，用無血清的RPMI-16403次800r/min5min5mlRPMI-1640培育液中，計數(shù)活細胞，置冰上備用。試劑及試驗器材RPMI-1640、離心管〔50ml50個、10ml吸管〔10支、無菌棉簽〔約一包50PE〔4000pH7.4～8.050mlHAH24孔培育板〔50塊、Tip頭〔100個、較大的濾膜〔5個〕試驗步驟〕的比例50mlRPMI-16401200r/min8min。2次。②留神吸出上清，顛倒離心管使管口向下，用無菌棉球吸凈殘留液體以避開稀釋PEG。37℃370.8ml0.7ml50%〔PEG此時肉眼可見有顆粒消滅，滴加過程要求持續(xù)60s，37℃靜置90s5min20ml37℃預(yù)溫的無血清RPMI-1640培育液以終止融合劑的作用，1min1ml，第2min2ml，后3min17ml，邊滴加邊搖動。800r/min7min沉淀細胞10ml490ml10％FCS-1640培育液中。240.5ml5%CO237℃培育箱中培育4HAT〔些液體至肯定的高度，依據(jù)需要參加適量的飼養(yǎng)細胞〕1416日參加HTHT〔100×5ml495ml10%FCS-1640交瘤細胞消滅后，吸取上清液，檢查抗體，及早液氮凍存?zhèn)浞莺涂寺』?。留意事?0～201個月左右才能消滅的。而且每個細胞群落明顯。適宜的無菌操作技術(shù)。下會消滅成團的細胞，影響本就不高的融合率。1.PEG有毒性或作用時間過長。2.牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進展嚴(yán)格的篩AHT含量缺乏。1/10以上時，即可檢測抗體陽性孔，連續(xù)三次檢測漸漸上升或維持在同一水平者，則可以做克隆化，一局部則冷藏起來長期保種用。六、抗體檢測〔ELISA間接法〕試驗儀器96孔微量反響板，微量加樣器，1.5ml離心管。試驗試劑α-LA酶標(biāo)抗抗體〔酶標(biāo)二抗IgG-HRPIgM-HRP包被液〔pH9.5N2CO31.59，NaHCO31000ml0.02%NaN3，0.22m膜過濾，4℃保存〔0.01mol/LpH7.4PBS-pH7.4PBSNacl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.1g，KCl0.2gHClNaOH調(diào)整配制成洗滌緩沖液DMSO1mg/mlTMB溶液，4℃避光保存。用前要檢查其狀態(tài)，假設(shè)有凝固，可用手溫將其溶化。底物緩沖液〔pH5.1.02gNaHPO4.122O3.68g100ml4H2O2。使用前按TMB：底物緩沖液：H2O2100：900：19ml加1ml10μl30%H2O2(即配即用)10%的小牛血清〔1ml9ml1×PBS中混勻〕2mol/LH2SO43.試驗步驟的碳酸鹽包被緩沖液〔pH9.5〕8μg/ml，每個聚100μl，4℃過夜。次日傾去凹孔內(nèi)的液體，用洗滌液洗3～5次。10%200μl，371～2h，3～5〕100μl37℃1～2h，洗滌，同時做空白、陰性及陽性孔比照滌液洗滌，最終一遍用雙蒸水〔DDW〕洗滌TMB100μl，3720～30min2mol/L50μl結(jié)果。也可在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白比照孔調(diào)零后測各孔OD值，OD2.1倍，即為陽性。七、雜交瘤細胞的克隆化〔有限稀釋法〕96100l飼養(yǎng)細胞液〔1.0×105胞〕10%血清的HT培育基稀釋至10個細胞/ml，0.1ml1個細胞。2③375%CO培育7～10到雜交瘤細胞布滿孔底1/3面積即可檢測抗體；標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。2④取抗體檢測陽性孔消化分別細胞，并轉(zhuǎn)種于24孔板中擴大培育。并凍存。留意事項：不易觀看，最好兩個人進展確認(rèn)。3～5次克隆才能穩(wěn)定。八、雜交瘤細胞的凍存10%FCS-1640培育液10%FCS-1640反復(fù)輕輕吹打貼附在瓶壁上的細胞，使細胞均勻分散懸?、?000r/min離心10min，棄上清液。細胞沉淀用10%二甲基亞砜保護液制成懸液，1.0×107細胞/ml④取樣，用無血清培育基把細胞懸液稀釋到200～2023個/毫升，和0.4％的胎盤藍溶液按1:1輕輕混合后，用移液槍點樣到血球計數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀看，計數(shù)，因活細胞排斥臺盼蘭，不被染色，其中藍色細胞是死細胞。存活率應(yīng)在95%以上 ⑥分裝冷凍管，冷凍管要將蓋子蓋緊，每瓶0.5～1ml，在酒精燈上封口冷凍管42h〔-70℃〕15h，最終沉入液氮中〔-195℃〕九、單克隆抗體的生產(chǎn)及純化動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗月齡〕0.3～0.5ml，7天后使用②收集對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，用生理鹽水洗滌兩次，1500r/min10min5×106個細胞/ml的懸液0.5ml處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞2～35～10ml5～10mg/ml分裝-70℃凍存?zhèn)溆?。單克隆抗體的純化〔飽和硫酸銨鹽析沉淀法〕試驗材料及試劑生理鹽水：0.9gNaCl100ml蒸餾水中，高壓滅菌0.01mol/LpH7.4PBS1000ml蒸餾水中溶解Nacl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.1g，KCl0.2gHClNaOHpH7.420min，保存于室溫。攪拌使大局部晶體溶解，室溫靜置過夜，可見局部硫酸銨結(jié)晶析出，沉于瓶底，上清即pH528%pH7.2.過濾備用磁力攪拌袋，透析袋試驗步驟4℃12023r/min15min，去