TTC肉湯二倍稀釋法測MIC課件

幾種抗菌藥物的最小抑菌濃度的測定－－MIC試驗

（微量肉湯二倍稀釋法）幾種抗菌藥物的最小抑菌濃度的測定－－MIC試驗

（微量肉湯1一、目的1、掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物MIC的基本步驟，能準(zhǔn)確測出各種抗菌藥物的MIC值，了解單藥的抗菌活性2、為后面的棋盤法設(shè)計棋盤做準(zhǔn)備，求取棋盤的中心濃度一、目的1、掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物MIC的基本步2二、意義1、通過對MIC值的測定了解藥物的體外抗菌活性2、為臨床選藥提供依據(jù)3、耐藥檢測二、意義1、通過對MIC值的測定了解藥物的體外抗菌活性3三、菌種1、大腸桿菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株25922）2、沙門氏菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株）3、金色葡萄球菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株）（以上三種菌株均由中國獸藥監(jiān)察所提供）三、菌種1、大腸桿菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株25922）4四、藥品硫酸慶大霉素（批號：含量：廠家：）阿莫西林（批號：含量：廠家：）硫酸四環(huán)素（批號：含量：廠家：）恩諾沙星（批號：含量：廠家：）阿米卡星（批號：含量：廠家：）氟苯尼考（批號：含量：廠家：）四、藥品硫酸慶大霉素（批號：含量：廠家：5五、培養(yǎng)基MH肉湯培養(yǎng)基、用去離子水配制5g/L顯色劑TTC（氯化三苯四氮唑）五、培養(yǎng)基MH肉湯培養(yǎng)基、用去離子水配制5g/L顯色劑TTC6六、器材96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、移液槍、1ml和200μl槍頭、EP管、錐形瓶、試管架、酒精燈、酒精棉球等分析天平、超凈工作臺、37度恒溫培養(yǎng)箱、烘箱六、器材96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、移液槍、1ml和2007七、方法步驟1、藥液的配制及除菌配制根據(jù)藥物的效價或是含量及所需要的體積，計算出藥物所需的量，并準(zhǔn)確稱取所需的各種抗菌藥物，用適宜的溶劑及稀釋及稀釋劑將藥物稀釋至所需的濃度。除菌抗菌素藥物通過過濾的方式過濾；化學(xué)合成類藥物通過過濾或是高壓滅菌的方式進行除菌。七、方法步驟1、藥液的配制及除菌82、不同的抗菌藥物原液配制所需的溶劑溶劑為PH4.5PBS緩沖液的：四環(huán)素類溶劑為PH6.0PBS緩沖液的：青霉素G，半合成青霉素類，頭孢菌素類，多粘菌素B硫酸鹽溶劑為PH7.8PBS緩沖液的：氨基糖苷類，林可或氯林可霉素2、不同的抗菌藥物原液配制所需的溶劑93、MIC的測定（微量二倍稀釋法）第一步：在96孔板每個孔加入含TTC的空白肉湯100μl。

圖表3、MIC的測定（微量二倍稀釋法）10第二步：在A/B/C三排的第一孔加配好的藥液A(濃度為512IU/ml或μg/ml)100μl，然后對藥物進行二倍稀釋。即，第一孔中加入藥液后用移液槍充分吹打（至少三次以上）使藥物與肉湯充分混勻，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻，照此重復(fù)直至最后一孔，吸取100μl棄去;此時每孔藥物濃度從左到右依次為：256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125(單位:IU/ml或μg/ml)

圖表TTC肉湯二倍稀釋法測MICppt課件11第三步：再在每一孔中加入稀釋好的菌液100μl,這樣就形成測定一個藥物MIC值的三次重復(fù)（A/B/C三排樣品）。此時每孔藥物濃度即最終藥物濃度從左到右依次為：128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06(單位:IU/ml或μg/ml)；

圖表TTC肉湯二倍稀釋法測MICppt課件12第四步：在同一塊板上的G排上做一排陰性對照（僅加空白肉湯不加菌液）和在H排上做一排陽性對照（加菌液不加藥液）第五步：將96孔板放入37度恒溫培養(yǎng)箱16～20小時后，觀察結(jié)果。

圖表

第四步：在同一塊板上的G排上做一排陰性對照（僅加空白肉湯不加13

123456789101112A①肉湯100ul②藥A100ul③菌液100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ul100ulB同A排C同A排D①肉湯100ul②藥B100ul③菌液100ulE同D排F同D排G陰性對照H陽性對照藥物濃度12864321684210.50.250.1250.0625

第一步第二步第三步第四步123456789101112A①肉湯100ulB同A排C14八、觀察及判斷結(jié)果

1、若有菌生長TTC會顯示紅色；若沒有細(xì)菌生長TTC則不變色。2、MIC值的判定：96孔板上橫排中未變紅色的最后一孔所對應(yīng)的濃度便為該藥的MIC值。3、觀察所做的陰性對照和陽性對照結(jié)果4、記錄結(jié)果并將每種藥物的MIC值報告老師八、觀察及判斷結(jié)果

1、若有菌生長TTC會顯示紅色；若沒有細(xì)15九、注意事項：1、無菌操作①除移液槍和96孔板外其他所有用具都需經(jīng)過高壓滅菌處理②超凈臺使用前后都需打開紫外燈進行消毒；不能拿酒精面球球擦擋板?、鄄僮髑跋词?，用酒精棉球擦手④每次槍頭過瓶口，瓶口都要經(jīng)火焰燒過；移液槍和槍頭不能在究竟燈上烤！⑤操作過程中加液盡可能不將96孔板蓋完全打開九、注意事項：1、無菌操作162、其他注意事項：（1）培養(yǎng)板上用標(biāo)簽紙做好標(biāo)記，寫明組別，做什么菌、什么藥，以及各組對照。（2）每藥做三個重復(fù)，每個板做一個陰性對照和一個陽性對照。（3）廢液缸，超凈臺內(nèi)用過的不需要的東西都必須放到廢液缸內(nèi)，不能在臺面亂扔。（4）實驗完后要收拾好臺面，所有公用設(shè)施恢復(fù)原位。2、其他注意事項：17十、記錄結(jié)果的格式例如：××菌對××藥的MIC值（μg/ml或是UI/ml）受試菌株藥物（UI/ml）四環(huán)素氟苯尼考金黃色葡萄球菌大腸桿菌沙門氏菌十、記錄結(jié)果的格式例如：××菌對××藥的MIC值（μg/ml18十一、討論1、微量肉湯二倍稀釋法應(yīng)注意那些環(huán)節(jié)才能準(zhǔn)確測定MIC？2、MIC試驗對臨床選藥的意義以及它的局限性？3、TTC的作用機理？十一、討論1、微量肉湯二倍稀釋法應(yīng)注意那些環(huán)節(jié)才能準(zhǔn)確測定M19十二、分組整個班分為6個組，每組11人。1、2組做8種藥對大腸桿菌的最小抑菌濃度3、4組做8種藥對沙門氏菌的最小抑菌濃度5、6組做8種藥對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度1、2、3組在今天上午完成實驗，4、5、6組在下午過來完成實驗。每個大組要做4塊96孔板，由4個同學(xué)來完成！十二、分