發(fā)酵與釀造技術(shù)4發(fā)酵滅菌課件

項(xiàng)目四發(fā)酵滅菌項(xiàng)目四學(xué)習(xí)目標(biāo)知識目標(biāo)1.知道發(fā)酵行業(yè)常用滅菌的原理和方法。2.知道無菌空氣的質(zhì)量要求。3.能陳述培養(yǎng)基滅菌的常用方法。4.能陳述影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素。5.能陳述空氣的除菌原理、流程和常用的方法；技能目標(biāo)1.能夠按照培養(yǎng)基滅菌工藝，進(jìn)行操作和控制。2.能根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，選擇合理的空氣凈化設(shè)備。3.能認(rèn)識發(fā)酵罐中主要部件，清楚它們的作用，進(jìn)行實(shí)罐滅菌。學(xué)習(xí)目標(biāo)知識目標(biāo)請大家思考：假如你是某單位化驗(yàn)室的檢驗(yàn)員，進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，不知什么原因培養(yǎng)基已受到污染，你并不知道，繼續(xù)進(jìn)行檢驗(yàn)操作時(shí)，結(jié)果將如何？有哪些原因?qū)е挛廴?？如何避免?/p>

請大家思考：假如你是某單位化驗(yàn)室的檢驗(yàn)員，進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進(jìn)行滅菌操作？1、由于雜菌的污染，使生物反應(yīng)中的基質(zhì)或產(chǎn)物因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降；2、由于雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，或在染菌后改變了培養(yǎng)液的某些理化性質(zhì)，使產(chǎn)物的提取和分離變得困難，造成收率降低或使產(chǎn)品的質(zhì)量下降；3、雜菌會大量繁殖，會改變反應(yīng)介質(zhì)的PH值，從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化；4、雜菌可能會分解產(chǎn)物，從而使生產(chǎn)過程失??；5、發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解，而使生產(chǎn)失敗.為防止雜菌的污染，哪些需要滅菌？培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣、菌種制作在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進(jìn)行滅菌操作？1、由于雜菌的污染，使生背景資料（一）概念:滅菌、消毒、除菌、防腐滅菌:用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中所有微生物的過程。包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消毒:用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。除菌:

用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。防腐:

用物理或化學(xué)方法抑制微生物的生長和繁殖。（低溫、高滲、缺氧、高酸度、干燥、防腐劑）背景資料（一）概念:滅菌、消毒、除菌、防腐（二）滅菌方法1、化學(xué)試劑滅菌法適用范圍：環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒2、射線滅菌法適用范圍：無菌室、接種箱

3、干熱滅菌法適用范圍：金屬或玻璃器皿4、濕熱滅菌法適用范圍：廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌5、過濾除菌法利用過濾方法阻留微生物適用范圍：制備無菌空氣（二）滅菌方法1、化學(xué)試劑滅菌法（三）濕熱滅菌原理熱阻（耐熱性）熱死時(shí)間：即在規(guī)定溫度下殺死一定比例的微生物所需要的時(shí)間。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在此溫度下，殺死全部微生物所需要的時(shí)間。熱阻：對熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對熱阻：指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。（三）濕熱滅菌原理熱阻（耐熱性）2.微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比，即

滅菌時(shí)間取決于培養(yǎng)基中所含的原始微生物數(shù)（No），滅菌的程度（Nt）和k值。當(dāng)Nt=0時(shí)，t=∞，

既無意義，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。

2.微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律在一定溫度下，微生物受熱致比熱死速率常數(shù)k

k↓，熱阻↑,t↑

滅菌速度常數(shù)K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的，K值愈小，則此微生物愈耐熱。10t(min)N/N0嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-451015202512111611010810510t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681060585654比熱死速率常數(shù)kk↓，熱阻↑,t↑10t(m（四）發(fā)酵設(shè)備簡介

發(fā)酵罐指工業(yè)上用于培養(yǎng)微生物或細(xì)胞的封閉容器或生物反應(yīng)裝置。機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐主要有罐體、攪拌器、擋板、軸封、空氣分布器、傳動裝置、冷卻管、消泡器、人孔、視鏡等。（四）發(fā)酵設(shè)備簡介發(fā)酵罐指工業(yè)上用于培養(yǎng)微生物或細(xì)胞的封閉任務(wù)一培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌一、滅菌溫度和時(shí)間的選擇

（1）滅菌溫度：速率常數(shù)與T有關(guān)，這可用阿累尼烏斯方程來表示：

K＝A*e－E/RTA：比例常數(shù)；E：殺死微生物所需的活化能；R：氣體常數(shù)A、E值視菌種而異，A＝1.34—1.36，一般殺死微生物的營養(yǎng)體的E＝200-270kj/mol，芽孢E＝400kj/mol，R＝1.987卡/K﹒mol。K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。K值越小，說明微生物的熱阻越大。任務(wù)一培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌一、滅菌溫度和時(shí)間的選擇滅菌溫度和時(shí)間的選擇（2）對營養(yǎng)成分由于大部分培養(yǎng)基受熱的破壞為一級分解反應(yīng)：dC/dt＝－KC（3）反應(yīng)物濃度同樣K'＝A'.e－E/RT當(dāng)溫度從T1升至T2，滅菌速度常數(shù)K和培養(yǎng)基成分破壞的速度常數(shù)K'的變化情況：K1＝A'.e－E/RT1K2＝A'.e－E/RT2滅菌溫度和時(shí)間的選擇（2）對營養(yǎng)成分滅菌溫度和時(shí)間的選擇（lnk2/k1）/（lnk‘2/k’1）=E/E‘由于滅菌時(shí)間的活化能E>培養(yǎng)基成分破壞的活化能E'，所以：lnK2/K1>lnK'2/K'1，即隨T升高，滅菌速率常數(shù)的增加倍數(shù)>培養(yǎng)基成分破壞的速率常數(shù)的倍加倍數(shù)。結(jié)論：在熱滅菌過程中，同時(shí)產(chǎn)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞兩個(gè)過，溫度升高，兩分過程的速率都升高，但其中微生物死亡速率隨T升高更為顯著。因此，我們在滅菌時(shí)選擇較高溫度，較短時(shí)間，以減少培養(yǎng)基的破壞，這就是通常所說的“高溫瞬時(shí)滅菌法”。滅菌溫度和時(shí)間的選擇（lnk2/k1）/（lnk‘2/k’1滅菌時(shí)間的計(jì)算例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210C溫度下實(shí)罐滅菌，原污染程度為每1ml有2×105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，已知1210C時(shí)滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機(jī)率為0.001時(shí)所需時(shí)間。解：N0=40×106×2×105=8×1012(個(gè))Nt=0.001(個(gè))k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)

由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個(gè)作用較為顯著，故實(shí)際保溫階段時(shí)間比計(jì)算值要短。滅菌時(shí)間的計(jì)算例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210連續(xù)滅菌時(shí)間的估算例2．某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每1ml含有2×105個(gè)雜菌，已知1310C時(shí)滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時(shí)間。解：N0=2×105(個(gè)/ml)Nt=0.001/(40×106)=2.5×10-11(個(gè)/ml)t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min連續(xù)滅菌時(shí)間的估算例2．某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)二.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素培養(yǎng)基成分油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機(jī)物等增加微生物的耐熱性低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護(hù)作用，隨著濃度增加，保護(hù)作用減弱，當(dāng)濃度達(dá)8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。二.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素培養(yǎng)基成分4.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素pH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH<6.0，H+易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促使其死亡?！嗯囵B(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時(shí)間愈短。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)（顆粒大?。┡菽号菽械目諝庑纬筛魺釋?，對滅菌極為不利，可加入少量消泡劑。培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量4.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素pH：pH6.0-8.0，微生三、培養(yǎng)基滅菌工藝（一）培養(yǎng)基的分批滅菌（實(shí)罐滅菌）分批滅菌就是指將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱實(shí)罐滅菌或間歇滅菌。過程包括：升溫、保溫和冷卻等三個(gè)階段。各階段對滅菌的貢獻(xiàn)：20%、75%、5%24016012080時(shí)間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫三、培養(yǎng)基滅菌工藝（一）培養(yǎng)基的分批滅菌（實(shí)罐滅菌）2401滅菌工藝過程分空氣過濾器滅菌并用空氣吹干夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內(nèi)通蒸汽達(dá)70℃左右取樣管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保溫保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定罐壓接近空氣壓力保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門夾套或蛇管中通冷水培養(yǎng)基降溫到所需溫度向罐內(nèi)通無菌空氣滅菌工藝過程分空氣過濾器滅菌夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，（二）連續(xù)滅菌（連消）連續(xù)滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐時(shí)進(jìn)行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱為連消。連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)被加熱到滅菌溫度（一般高于分批滅菌溫度，130～160℃），短時(shí)間保溫（一般為5～8min）后，被快速冷卻，再進(jìn)入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。（二）連續(xù)滅菌（連消）連續(xù)滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連消塔維持罐冷卻管噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵連連續(xù)滅菌流程連續(xù)滅菌流程分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（1）殺菌鍋內(nèi)滅菌固體培養(yǎng)基滅菌（2）種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌（3）空氣總過濾器和分過濾器滅菌（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（1）殺菌鍋內(nèi)滅菌固體培（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（4）種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌（5）發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐實(shí)菌（6）發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌（7）消泡劑滅菌（8）補(bǔ)料實(shí)罐滅菌（9）尿素溶液滅菌（三）培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件（4）種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌任務(wù)二空氣凈化（一）空氣中微生物的分布空氣(即大氣)是一種氣態(tài)物質(zhì)的混合物，此外，尚有懸浮在空氣中的灰塵，主要由構(gòu)成地殼的無機(jī)物質(zhì)微粒、煙灰、植物的花粉以及種類繁多的細(xì)菌和其他微生物所組成。

空氣中常見的微生物種類及其大小

任務(wù)二空氣凈化（一）空氣中微生物的分布

（二）發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

發(fā)酵用的無菌空氣，達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)：

①連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。②空氣的壓強(qiáng)（表壓）為0.2～0.4MPa。③進(jìn)入過濾器之前，空氣的相對濕度φ≤70%。④進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高10～30℃。⑤壓縮空氣的潔凈度，在設(shè)計(jì)空氣過濾器時(shí)，一般取失敗概率10-3為指標(biāo)。也可以把100級作為無菌空氣的潔凈指標(biāo)。（二）發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵用的無菌空氣，達(dá)（三）空氣除菌方法輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β射線、γ射線、紫外線(2265?~3287?)加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機(jī)產(chǎn)生的熱量靜電除菌：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。過濾除菌：采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質(zhì)有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機(jī)合成纖維、有機(jī)和無機(jī)燒結(jié)材料等等。（三）空氣除菌方法輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β（四）空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)1.過濾除菌的種類絕對過濾：過濾介質(zhì)的濾孔小于細(xì)胞和孢子。如聚乙烯醇縮甲醛樹脂（PVF）制成的0.3m的微孔濾膜。深層介質(zhì)過濾：介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細(xì)胞。如用棉花、玻璃纖維和顆?；钚蕴刻畛涞倪^濾器。（四）空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)1.過濾除菌的種類2.深層介質(zhì)過濾的原理

微粒隨氣流通過濾層時(shí)，由于濾層纖維的層層阻礙，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動速度和方向的繞流運(yùn)動，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生慣性沖擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力沉降、靜電引力等作用把微粒滯留在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)過濾的目的。2.深層介質(zhì)過濾的原理微粒隨氣流通過濾層時(shí)，由于濾層3.空氣過濾除菌介質(zhì)（１）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)棉花：常用，有彈性，纖維長度適中。玻璃纖維：直徑小，不易折斷，過濾效果好?；钚蕴浚阂筚|(zhì)地堅(jiān)硬，顆粒均勻。

缺點(diǎn)：體積大，裝填費(fèi)時(shí)費(fèi)力，松緊度不易掌握，空氣壓降大。（２）紙類過濾介質(zhì)——超細(xì)玻璃纖維紙

3~6張疊在一起使用，過濾效率高，壓降小。缺點(diǎn)：強(qiáng)度不大（特別是受潮后）。3.空氣過濾除菌介質(zhì)（１）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程空氣空壓機(jī)貯氣罐冷卻除油水加熱空氣預(yù)處理總過濾器分過濾器無菌空氣

空氣過濾發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大致過程空氣空壓機(jī)貯氣罐（五）空氣的預(yù)處理1.原理：除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和濾器壽命；措施：建吸風(fēng)塔、粗過濾器（布袋過濾器、填料過濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置等）、高效前置過濾器降溫：防燒傷介質(zhì)及水分蒸發(fā)嚴(yán)重，對發(fā)酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長菌堵塞（因水滴）