蛋白酶活性電泳實(shí)驗(yàn)方案

蛋白酶活性電泳活性電泳(明膠酶譜法)一、試驗(yàn)原理里的明膠，最終用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可消滅白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與酶的量和比活成正比。Triton中震蕩洗脫時(shí)，由于SDS被Triton結(jié)合而去除，從而使酶恢復(fù)了活性，此步留意上樣緩DTT等復(fù)原性物質(zhì)。過對該位置酶的回收與質(zhì)譜鑒定，得到該酶局部氨基酸序列。二、材料與方法試劑與溶液配制試劑和儀器：馬斯亮藍(lán)R250購自sigma公司，為電泳純；TritonX-100，CaCl2·2H2O，Brij-3530%丙烯酰胺溶液〔29:1〕，5marker等購自康為世紀(jì)公司。水為去離子水或超純水。milipore超濾管等溶液配制5×SDS-電泳緩沖液94gSDS5.0g，加11-2次，最好使用穎配制的電泳液。明膠儲液〔10mg/ml〕10ml4℃。假設(shè)凝固成膠凍狀可用溫水浴解凍。10過硫酸銨〔W/V〕1g10ml442過期會(huì)凝膠效果會(huì)減弱，可適當(dāng)增加用量。凝膠配制：10%SDS-凝膠之分別膠〔1.0mg/ml明膠〕dH2O30%丙烯酰胺溶液4×分別膠緩沖液TEMED10mg/ml明膠Total5%濃縮膠的配置dH2O30%丙烯酰胺溶液4×濃縮膠緩沖液TEMED

3ml3.3ml2.5ml0.1ml0.004ml1ml10ml4.56ml1.36ml2.0ml0.1ml0.008ml10mg/ml明膠 0ml Total 8ml配制梯度膠的丙烯酰胺凝膠輕溶液〔5%〕dH2O30%丙烯酰胺溶液4×分別膠緩沖液TEMED10mg/ml明膠Total

7.25ml2.50ml3.75ml0.1ml0.008ml1.5ml15ml配制梯度膠的丙烯酰胺凝膠重溶液dH2O

15%1.0ml

20%030%丙烯酰胺溶液 7.50ml 10.04×分別膠緩沖液 3.75ml 3.75ml10%過硫酸銨

0.1ml

mlTEMED 0.01ml 0.01ml10mg/ml明膠 1.5ml 1.5ml Total

15ml

15ml1.2.5洗脫液〔1×〕25ml1000ml即可。1.2.6孵育液〔1×〕配法：1Tris6.06gCaCl2·2H2O0.74〔CaCl20.555gBrij-35g800mlHClpH7.61000ml。2)2)40gNaCH3COOH·3H2O溶于適量水，6molCH3COOH168mL，CaCl2·2H2O0.74g〔CaCl20.555g〕，Brij-350.2g，NaCl11.7g800，ml)2gR-2501L100ml異丙醇參加上260ml去離子水，攪拌溶解；用濾紙過濾除去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。1.2.8考馬斯亮藍(lán)脫色液〔400ml〕配法：甲醇：乙酸：水=5：1：4。2試驗(yàn)方法蛋白酶樣品制備3kD6500rpm濃縮，得到粗酶液，﹣20℃保存。樣品液蛋白酶活性的測定〔福林一酚試劑法〕50mg0.2mol/L鹽酸溶Tris-HCl(pH9.0)100mL，分別配成0-100l0.4mol/L5l波長比色，測光密度酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)作比照管。酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。。F為酶液最終稀釋倍數(shù)，15為反響時(shí)間(分鐘)。調(diào)整樣品液的濃度，計(jì)算出凝膠電泳所需酶量〔約200U〕，假設(shè)樣品液比活不夠高，須進(jìn)一步濃縮以提高樣品比活，或適當(dāng)提高加樣量?；钚阅z操作步驟〔gelatinzymogram〕配膠高濃度丙烯酰胺溶液內(nèi)參加蔗糖可以穩(wěn)定梯度的形成。操作步驟：可使用蠕動(dòng)泵)。TEMED1mm厚的小板膠約需要輕重溶1mmTEMED并混勻。3〕關(guān)閉梯度混合器的輸出閥和兩液槽間的連通閥，在貯液槽中參加定量的凝膠輕溶防止堵塞。4〕在混合槽中參加等量凝膠重溶液，完全翻開連通閥，開啟磁力攪拌器，調(diào)整轉(zhuǎn)速至復(fù)性。5〕翻開幾毫升輕溶液不致過快流入凝膠夾層影響梯度形成。1ml1h充分聚合。灌制濃縮膠，預(yù)備樣品，加樣進(jìn)展電泳。留意：一次可同時(shí)跑兩板膠，配膠時(shí)一板為添加明膠的活性膠，一板為無明膠的一般膠，配膠過程盡量全都，一般膠做比照。上樣，樣品與非復(fù)原性上樣緩沖液混合，室溫靜置10min，不能加熱。完畢。活性膠的處理直接酶譜法1)pH5%-20%，電泳完畢后，洗脫，漂洗；pH503h；考馬斯亮藍(lán)R-250染2〕活性膠孵育最正確時(shí)間最適pH孵育液內(nèi)，分別孵育1h、3h、6h、12h。孵育完畢后操作同上。3〕蛋白酶電泳后位置的標(biāo)定A111pH孵育液BC膠蛋白條帶進(jìn)展比照，確定ＡＢ膠亮帶對應(yīng)的蛋白酶在Ｃ膠中的或許位置。4〕將Ｃ膠中亮帶對應(yīng)的位置四周幾條蛋白條帶分別切下，回收。操作見表1。pHpH4.0pH7.0pH8.5pHpH4.0pH7.0pH8.53h3h3h濃SDS水漂洗度A5%-振蕩洗脫20min〔明膠〕20%30min×2×21h1hA梯度活性凝膠5%-〔明膠〕 20%振蕩洗脫20minpH8.53h6h12h〔明膠〕明膠〕明膠〕5%-20%5%-20%5%-20%振蕩洗脫振蕩洗脫20min20minpH8.53h2%2h，pH8.53h直接染色活性膠孵育最適pH由圖1看出pH8.5的條件下，凝膠中的酶與底物明膠反響生成的條帶數(shù)量最多，亮度最大。1pH孵育條件下明膠活性電泳的差異1、2、3pH4.0、7.0、8.53小時(shí)的條帶活性膠孵育最正確時(shí)間2得出，在pH8.5條件下，隨孵育時(shí)間延長條帶數(shù)增多，孵育4h后，條帶3h效果最好，條帶數(shù)最多且條帶清楚。2pH8.5孵育不同時(shí)間下明膠活性電泳的差異1、2、3、48.51h、2h、3h、4h的條帶 A B3SDS-結(jié)果BSDS-復(fù)性浸泡酪蛋白孵育結(jié)果爭論從明膠活性電泳結(jié)果可以看出，粗酶液中含有多種蛋白酶，但大局部條帶結(jié)果〔3A〕看，對應(yīng)位置上并無蛋白亮帶，復(fù)性后浸泡酪蛋白孵育也無亮帶。References:JE.科林根等，精編蛋白質(zhì)科學(xué)試驗(yàn)指南,Dass,S.B.andC.G.Dosoretz,etal.(1995).“Extracellularproteasesproducedbythewood-degradingfungusPhanerochaetechrysosporiumunderligninolyticandnon-ligninolyticconditions.“Archivesofmicrobiology163(4):254-258.Liota,L.A.andW.G.Stetler-Stevenson(1990)CancerBiology,1,96-106Mitsuhashi,W.andA.Oaks(1994).“Developmentofendopeptidaseactivitiesinmaize(ZeamaysL.)endosperms.“Plantphysiology104(2):401-407.Morikawa,M.andY.Izawa,etal.(1994).“Purif