高中生物-5.3-血紅蛋白的提取和分離-新人教版選修1

課題3

血紅蛋白的提取和分離高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1課標(biāo)領(lǐng)航1．概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理。2．能根據(jù)凝膠色譜過程中的現(xiàn)象和結(jié)果，評價實驗操作的過程是否規(guī)范，分析實驗結(jié)果。3．嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本過程和方法。【重點】凝膠色譜法、電泳法基本原理?！倦y點】實驗操作的過程及分析。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1情境導(dǎo)引為年老多病的人注射丙種球蛋白，可以在一定程度上增強其身體的抵抗力。在動物體內(nèi)，丙種球蛋白和許多蛋白質(zhì)混合在一起。要獲得純凈的丙種球蛋白制品，就必須進(jìn)行提取和分離。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)了樣品中各種分子的分離。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1蛋白質(zhì)分離的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。

一、基礎(chǔ)知識高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（一）凝膠色譜法2.凝膠：

大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。

根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進(jìn)行分離。1.概念：（分配色譜法）高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過程可表示為圖中哪一個B高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修13、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1思考：所有的蛋白質(zhì)都可以用凝膠色譜法

來分離嗎？

進(jìn)行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性呢？

不是，能分離的蛋白質(zhì)分子必須是具有相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修11、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。2、作用：能夠抵制（）對溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值（二）緩沖溶液高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修13、緩沖溶液的配制

通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內(nèi)思考：說出人體血液中緩沖對？NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1三、電泳---血紅蛋白的分離鑒定方法1.概念：帶電粒子在

作用下發(fā)生

的過程。2.原理：

許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上

或

。在電場的作用下，這些帶電分子會向著的

的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子

以及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的

，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。電場遷移可解離正電負(fù)電與其所帶電荷相反帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修13.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素

決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

聚丙烯酰胺凝膠電泳在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。

1.原理：

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。2.SDS作用機理:高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1①瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需要事先處理；電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。②測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是因為該方法分離蛋白質(zhì)完全取決于分子的大小，而非所帶電荷的性質(zhì)和分子的大小、形狀。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1二、實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理—粗分離（透析）—純化—純度鑒定（電泳）高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團(tuán)1.血液有哪些成分？二、實驗操作：知識回顧高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1每個肽鏈環(huán)繞（），此基團(tuán)可攜帶（）。血紅蛋白因含有（）而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。一個亞鐵血紅素基團(tuán)一分子氧或一分子二氧化碳血紅素高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修12與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點?這一特點對你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白答:血紅蛋白是有色蛋白,因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液.這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡化了實驗操作.

1.你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

采集得到血液（加入抗凝血劑檸檬酸鈉）（二）操作過程防止血液凝固高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修11、樣品的處理（1）紅細(xì)胞的洗滌A、洗滌目的:B、分離時采用

離心，用

洗滌，重復(fù)洗滌

，直至

為什么要低速短時離心？防止白細(xì)胞沉淀（P69）C、能否用蒸餾水代替生理鹽水？去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化低速短時間五倍體積的生理鹽水三次

上清液不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈不能，生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓而不至于破裂，若紅細(xì)胞提前破裂，使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大分離難度。D、為什么要緩慢攪拌？防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1洗滌過程圖解：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色再加入用（）的（）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌,緩慢攪拌10MIN，（）離心.五倍體積如此重復(fù)洗滌（）次，直至上清液中已沒有（），表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。三黃色生理鹽水低速短時間高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

二、實驗操作高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（2）釋放血紅蛋白思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？

（使用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁┠康姆治觯赫麴s水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂（蒸餾水，40%體積的甲苯）高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1磁力攪拌器攪拌器轉(zhuǎn)子高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1攪拌器正在工作高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修13.分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000r/mim的速度離心10mim后，可以看出溶液分為4層，從上往下數(shù)，第一層是無色透明的甲苯層，第二層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第三層為紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第四層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀物，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1第1層：（）甲苯層第2層：（）色薄層固體（）的沉淀層，

第3層:（）的液體（）的水溶液層

第4層:其它雜質(zhì)（）的沉淀層無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1用

過濾，除去

，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。濾紙脂溶性沉淀層高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1.分離血紅蛋白分離過程:紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

2.粗分離----透析（去除分子量較小的雜質(zhì)）（1）用

方法進(jìn)行粗分離，透析袋由半透膜制成，常用。將透析袋放入

溶液中進(jìn)行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是

。

透析玻璃紙、腸衣、膀胱膜

透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)磷酸緩沖高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1取()ml的血紅蛋白溶液裝入（）中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的（）中，pH為（），透析12小時，目的是（）或用于更換樣品中的（）。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液4.透析（粗分離）1高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1透析過程中如何去除無機鹽離子和小分子有機物？半透膜的選擇透過性，大分子物質(zhì)不能通過半透膜，離子和小分子能夠通過半透膜。在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散進(jìn)入到pH＝7的磷酸緩沖液中。透析過程中為何使用pH＝7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴散。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：2、血紅蛋白的釋放：3、分離血紅蛋白溶液：4、透析：（如何除無機鹽離子和小分子有機物質(zhì)呢？）

血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無黃色在蒸餾水和甲苯（？）作用下，紅細(xì)胞破裂釋放紅細(xì)胞破碎混合液→中速長時離心（2000c/min×10min）→濾紙過濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（二).凝膠色譜操作----1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫血紅蛋白的純化高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修12.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1裝配好的凝膠柱高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。

②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：

A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。

B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。50cm高（2）凝膠色譜柱的裝填高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

教材P70：為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果裝填不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，影響分離的效果。思考高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1(3)樣品的加入和洗脫①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊

②滴加透析樣品：用量為1mL

③樣品滲入凝膠床：樣品完全滲進(jìn)凝膠層

④洗脫：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫

⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1(3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。②加透析樣品高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修13.樣品的加入和洗脫高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④再調(diào)整緩沖液面洗脫：⑤收集：待（）接近色譜柱底端時收集頂端樣品完全進(jìn)凝膠層紅色的蛋白質(zhì)色譜柱制作成功的標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致的移動記高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1收集得到的純化后的蛋白高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修14、純度鑒定（電泳）SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳1、垂直板電泳裝置2、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；3、微量進(jìn)樣器（可用微量移液器代替）判斷（）的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。純化高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（5）裝槽、點樣：

拔出梳子→將膠板固定在電泳槽上（凹板一側(cè)向內(nèi)）→在電泳槽中加入緩沖液→點樣。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（6）電泳：高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1（7)、剝膠、染色及脫色

凝膠板剝離：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加染色液染色，然后用脫色液脫色。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1(8)、結(jié)果高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實驗結(jié)果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1五、操作提示1．紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)、________與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白：離心速度過高和時間過長會使_______等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。離心速度白細(xì)胞2．色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用________加熱，加速膨脹。3．凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。4．蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶__________地移動，說明色譜柱制作成功。沸水浴均勻一致高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1(1)在加樣示意圖中，正確的加樣順序是_________________________。(2)用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別是①______________、②貼著管壁加樣、③______________。(3)等樣品__________時，才加入緩沖液，待______________________接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每______________mL收集一管，連續(xù)收集?！緡L試解答】

(1)④→①→②→③(2)不要破壞凝膠面使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(3)完全進(jìn)入凝膠層紅色的蛋白質(zhì)5高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1【探規(guī)尋律】對分離效果的判斷(1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。(2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1【互動探究】

(1)凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些事項？(2)血紅蛋白溶液是如何分離的？【提示】

(1)①裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點是：節(jié)約時間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。②裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。③裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。思考高中生物_5.3_血紅蛋白的提取和分離_新人教版選修1血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離