花粉生活力測定課件

實驗五花粉生活力的測定

實驗五花粉生活力的測定

1一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握花粉生活力測定的方法花粉一、實驗?zāi)康幕ǚ?二、實驗原理作物雜交工作中，往往會遇到父母本花期不遇，必須采集花粉短暫貯藏，經(jīng)貯藏的花粉及其生活力如何，必須經(jīng)過測定，以保證雜交效果。此外，花粉的生理研究，作物雄性不育和遠(yuǎn)緣雜交都要鑒定花粉育性和生活力。正常條件下花粉在雌蕊上萌發(fā)的能力，就是花粉的生活力。

花粉生活力的高低直接影響植物授粉、受精乃至坐果?；ǚ凵盍y定的方法較多，常用的有：形態(tài)鑒定、花粉發(fā)芽鑒定、染色鑒定

。二、實驗原理作物雜交工作中，往往會遇到父母本花期不遇，必須采3形態(tài)鑒定：花粉有無生活力在形態(tài)上有明顯差異，即形態(tài)是否發(fā)育正常，其內(nèi)部淀粉等內(nèi)含物是否充實。發(fā)育不正常的花粉，內(nèi)含物不充實而空秕，形狀也不規(guī)則，大小參差不齊。而正?；ǚ蹆?nèi)含物充實飽滿，形狀規(guī)則，大小整齊。因內(nèi)部含有較多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反應(yīng)，遇水易吸漲而破裂。一般適用于不育系及遠(yuǎn)緣雜交后代花粉形態(tài)和育性的鑒定?！锖啽悖且话阌糜谝蟛粐?yán)格新采集的花粉形態(tài)鑒定：★簡便，但是一般用于要求不嚴(yán)格新采集的花粉4花粉發(fā)芽鑒定：配制一定濃度的蔗糖溶液等作培養(yǎng)基，在人工控制條件下進(jìn)行花粉發(fā)芽試驗，根據(jù)花粉發(fā)芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉數(shù)小時后直接觀察柱頭花粉萌發(fā)伸長情況。

染色鑒定：用不同的化學(xué)試劑如氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride、C12H15N4Cl，簡稱TTC或四唑）、聯(lián)苯胺茶酚等快速鑒定花粉生活力?；ǚ郯l(fā)芽鑒定：配制一定濃度的蔗糖溶液等作培養(yǎng)基，在人工控制條5三、實驗用品1、材料正在開花的植株花粉（百合）2、器具蓋、載玻片凹式載玻片培養(yǎng)皿滴管鑷子解剖針吸水紙水浴鍋恒溫箱

天平

燒杯玻棒電爐熒光顯微鏡普通顯微鏡3、藥品蒸餾水硼酸蔗糖瓊脂聯(lián)苯胺α-奈酚碳酸鈉過氧化氫磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀氯化三苯基四氮丙酮二丙酸酯熒光素三、實驗用品6四、內(nèi)容與方法（一）培養(yǎng)法：1、配置培養(yǎng)基取100ml蒸餾水中，加1~2g（即1%~2%）瓊脂煮開，使之溶解，然后再加入一定量的蔗糖或葡萄糖和0.01g硼酸，制成不同濃度（5%、10%、15%、20%）的蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。2、制片用玻棒蘸少許培養(yǎng)基，趁熱滴入凹形載玻片，放置片刻，待凝固后，撒上少許花粉粒。注意要均勻，不可過多，否則，在顯微鏡下，不易分清數(shù)目。3、培養(yǎng)將制好的玻片放于培養(yǎng)皿，下面墊有脫脂棉，加入少量水，以保持濕度。將培養(yǎng)皿蓋好，置于20~25℃恒溫箱中。四、內(nèi)容與方法（一）培養(yǎng)法：74、鏡檢在顯微鏡下隔一定時間檢查一次（花粉發(fā)芽快的經(jīng)過幾個小時即可觀察到已經(jīng)發(fā)芽，慢的需24小時以上），若發(fā)現(xiàn)花粉已發(fā)芽時，就隨機(jī)地在顯微鏡下取5個視野，記錄花粉粒總數(shù)和發(fā)芽數(shù)，算出平均值，將觀察結(jié)果填入表內(nèi)。

花粉發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)，以花粉管伸長超出花粉直徑為準(zhǔn)。若花粉發(fā)芽率在5%以下，為極弱，不能采用。（花粉發(fā)芽率=發(fā)芽花粉總數(shù)\花粉總數(shù)*100）培養(yǎng)過程要密切觀察，不可使花粉管萌發(fā)的太長，否則難以計數(shù)?！锱囵B(yǎng)基法能夠統(tǒng)計出百分率，準(zhǔn)確度高，但是操作相對復(fù)雜，而且花粉發(fā)芽條件與實際不完全相符易受培養(yǎng)基配方的影響導(dǎo)致結(jié)果的偏差。4、鏡檢★培養(yǎng)基法能夠統(tǒng)計出百分率，準(zhǔn)確度高，但是操作相對8配置培養(yǎng)基（100ml水+1g+瓊脂+0.01g硼酸+5-20g糖）

煮沸溶化用玻棒分裝與凹玻片中

播撒花粉置于培養(yǎng)皿中20-25℃恒溫培養(yǎng)數(shù)小時

保持濕度在顯微鏡下鏡檢計數(shù)【注意事項】1.不同種類植物的花粉萌發(fā)所需溫度、蔗糖和硼酸濃度不同，應(yīng)依植物種類而改變培養(yǎng)條件。2.此法也可用于觀察花粉管在培養(yǎng)基上的生長速度以及不同蔗糖濃度，離體時間，環(huán)境條件等因素對花粉活力的影響。3.不是所有植物的花粉都能在此培養(yǎng)基上萌發(fā)，本法適用于易于萌發(fā)的(葫蘆科等)植物花粉活力的測定。配置培養(yǎng)基（100ml水+1g+瓊脂+0.01g硼酸+59（二）聯(lián)苯胺法：（染色法）

具有生活力的花粉含有活躍的過氧化物酶。此酶能利用過氧化氫使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉有無活性。實驗中甲液成分為聯(lián)苯胺，α-萘酚、碳酸鈉，乙液成分為過氧化氫。H2O2+酚醌+H2O過氧化氫酶（無色）（紅色、玫瑰紅色）（二）聯(lián)苯胺法：（染色法）H2O2+酚101、配制藥液a．0.2克聯(lián)苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液；b．0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液；c．0.25克的碳酸鈉溶解在100毫升的蒸餾水中。以上三種溶液分別放入棕色瓶中備用d.使用時將這三種溶液等量配成“甲液”，放入棕色滴瓶中備用，e.將過氧化氫用蒸餾水稀釋成0.3%的溶液作為“甲液”，隨配隨用。2、觀察取花粉少許撒入凹型載玻片，然后在花粉上滴“甲液”一滴，片刻后，再滴入“乙液”一滴，仔細(xì)攪勻，蓋上蓋玻片。經(jīng)3～5分鐘后，再放在顯微鏡下檢查。有生活力的花粉呈紅色或玫瑰紅色，不著色者為無生活力的花粉。為了確定具有生活力的花粉百分率，要連續(xù)觀察3～5個視野，求其平均值，將觀察結(jié)果填入表內(nèi)。1、配制藥液11將適量花粉置于載玻片上先滴1滴甲液，再滴1滴乙液充分反應(yīng)顯微鏡下鏡檢計數(shù)，紅色的為有活力的花粉

【注意事項】滴加甲液和乙液后，會產(chǎn)生大量的氣泡，為了不影響觀察，應(yīng)待反應(yīng)充分完畢后在加蓋玻片觀察，可以用鑷子輕輕攪動，加速反應(yīng)，待氣泡基本消失后方可觀察。統(tǒng)計生活力的方法同前。

★染色法用時短，見效快，但顏色判斷易受個人因素影響，導(dǎo)致結(jié)果有較大差別。將適量花粉置于載玻片上【注意事項】12（三）TTC法：（染色法）TTC即2、3、5-三苯基四唑氯化物。主要原理在于檢驗花粉呼吸過程中脫氫酶的活性。2、3、5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的氧化狀是無色的，被氫還原時成紅色的TTF。具有活力的花粉呼吸作用較強(qiáng)，由于呼吸作用產(chǎn)生的氫能使TTC還原成TTF，因此花粉便染成紅色；而無生命的花粉沒有呼吸代謝活力，TTC不被還原，因而不著色。所以，可根據(jù)花粉染不染成紅色來判斷有無生命力，從而測定花粉生活力。（三）TTC法：（染色法）131、配制溶液（1）磷酸緩沖液：在100ml的蒸餾水中，溶解0.832克的磷酸氫二鈉和0.273克的磷酸二氫鉀,調(diào)整pH值為7.17。（2）TTC溶液：稱取0.02~0.05克(不同植物所用的量是不同的)的TTC溶解在10ml的磷酸緩沖液中,溶液配好后裝入棕色瓶內(nèi)，置入暗處?！咀⒁馐马棥恳蚵然交倪蛴卸?，操作時要注意安全。2、操作步驟（1）取少量花粉放在載玻片上，并在花粉上滴上1~2滴配制液，用玻璃棒混合蓋上蓋玻片。（2）將載玻片置于恒溫箱中（35~40℃）約15~20分鐘。（3）在顯微鏡（10X10）下觀察：凡具有生活力的花粉呈紅色，部分喪失生活力的呈淡紅色，無色的是死的和不育的花粉粒。3、觀察和測定結(jié)果：每片觀察3個視野，并統(tǒng)計具有生活力的花粉的百分率。1、配制溶液2、操作步驟3、觀察和測定結(jié)果：每片觀察3個視野14（四）熒光法：1、溶液配制（1）50mg二丙酸酯熒光素溶于10ml丙酮中。（2）0.5M蔗糖溶液100ml.（3）取10ml0.5M蔗糖溶液，將5mg/ml二丙酸酯熒光素溶液逐滴加入蔗糖液中至飽和，為染液。2、操作步驟（1）滴1滴染液于載玻片上。（2）將供試花粉撒在染液中。（3）靜置5分鐘。（4）加蓋片后于熒光顯微鏡下觀察。（激發(fā)BG12）（四）熒光法：15五、結(jié)果與分析請思考1、將培養(yǎng)基法和染色法兩種方法測得的結(jié)果列表記錄，并計算花粉的生活力。2、比較測定花粉生活力三種方法的優(yōu)缺點。3、繪制一花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。五、結(jié)果與分析請思考1、將培養(yǎng)基法和染色法兩種方法測得的結(jié)果16花粉生活力測定ppt課件17形態(tài)鑒定（1）在載玻片上置少量正常的稻、麥或棉的新鮮花粉，于低倍顯微鏡下觀察花粉形態(tài)。不同育性和生活力的花粉在形態(tài)上有明顯差異。水稻和小麥不育花粉空秕畸形，可育花粉飽滿球形；棉花不育花粉呈半圓形和棒狀，大小也參差不齊，可育花粉均為圓形，大小整齊一致。（2）與形態(tài)觀察相同，但在有花粉的載玻片上滴1滴1%I—IK，再觀察花粉是否染色和染色深淺情況，以判斷花粉內(nèi)含物的充實度。正?；ǚ蹜?yīng)有較多的淀粉粒，遇I—IK呈紫黑色，不正常的染色淺或不染色。對于新采集的花粉來說，還有一個更為簡便的鑒定方法——形態(tài)鑒定法。將花粉用解剖針播于一般載玻片上，然后直接放到顯微鏡下觀察，根據(jù)形態(tài)特征，判斷花粉的生活力狀況，一般來說，畸形、皺縮、小形化等均為無生活力花粉，而有光澤、飽滿、具有本品種花粉典型特征等性狀的均為有生活力花粉。形態(tài)鑒定對于新采集的花粉來說，還有一個更為簡便的鑒定方法——18要根據(jù)各種植物花粉的特點，采取適當(dāng)?shù)谋４娣椒ā；ǚ凵盍Φ臏y定方法很多，其中發(fā)芽試驗手續(xù)較復(fù)雜，設(shè)備要求較高，需時也較長。為了簡易而迅速的測定花粉生活力，也常采用化學(xué)染色的方法，但是此法也有缺點，就是染上色的花粉不一定都具有生活力，因為染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不能正常發(fā)芽的花粉，所以一般常用而且較為可靠的方法仍然是采用花粉發(fā)芽