腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移實驗技術(shù)課件

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移實驗技術(shù)首都醫(yī)科大學2015.11腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移實驗技術(shù)首都醫(yī)科大學目錄一、概述二、細胞劃痕實驗三、Transwell四、裸鼠尾靜脈注射實驗五、總結(jié)目錄一、概述一、概述腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移體外體內(nèi)細胞劃痕實驗Transwell裸鼠尾靜脈注射一、概述腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移體外體內(nèi)細胞劃痕實驗Transwell二、細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗是一種簡單易行的檢測細胞運動的方法，實驗成本低，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細胞的遷移能力。二、細胞劃痕實驗細胞劃痕實驗是一種簡單易行的檢測實驗優(yōu)點：1.在一定程度上模擬了體內(nèi)細胞遷移的過程。2.適合研究細胞與胞外基質(zhì)（ECM）、細胞與細胞之間相互作用引起的細胞遷移。3.與包括活細胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分析細胞間的相互作用。4.研究細胞遷移的體外實驗中最簡單的方法。二、細胞劃痕實驗實驗優(yōu)點：二、細胞劃痕實驗實驗材料：細胞樣品儀器、耗材：6孔板marker筆直尺槍頭試劑、試劑盒：無血清培養(yǎng)基、PBS二、細胞劃痕實驗實驗材料：二、細胞劃痕實驗1.所有能滅菌的器械都要滅菌2.超凈工作臺

紫外線消毒30min注：需要滅菌的器材包括——離心管、吸管筒、移液槍、槍頭等二、細胞劃痕實驗1.所有能滅菌的器械都要滅菌二、細胞劃痕實驗4.每孔加入5X105個細胞并培養(yǎng)約24h注：1.數(shù)量以過夜貼壁能鋪滿為宜，適當調(diào)整

2.數(shù)量少時可培養(yǎng)一段時間至鋪滿板底

（3.6孔板背面畫線5-6條）二、細胞劃痕實驗（3.6孔板背面畫線5-6條）二、細胞劃痕實驗5.用1ml槍頭垂直于孔板和線制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致注：.人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實驗結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷二、細胞劃痕實驗二、細胞劃痕實驗6.吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞后，再加入無血清培養(yǎng)基，根據(jù)需要設加實驗組、對照組。注：沖洗時溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細胞二、細胞劃痕實驗6.吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞后7.放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，（6），12，24小時取樣，拍照。8.計算、比較、分析①imageJ軟件計算每個視野的劃痕面積②/en/二、細胞劃痕實驗7.放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，（6），12，2新：德國IBIDI（易必迪）技術(shù)1.準備細胞，培養(yǎng)液，cultureInsert。2.將細胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。3.細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。4.每隔4-6小時拍照記錄。5.根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果二、細胞劃痕實驗新：德國IBIDI（易必迪）技術(shù)1.準備細胞，培養(yǎng)液，cul談幾點問題：1.細胞的選擇：一般適用于上皮，纖維樣細胞系a.本身有遷移能力，且較強。b.有極性，方便測量，觀察。c.對無血清有較強的忍受力。2.觀察的時間：一般為0、6、12、24ha.時間太久，無血清，易死亡，相對堅強b.時間太久，細胞繁殖，假陽性

二、細胞劃痕實驗談幾點問題：2.觀察的時間：一般為0、6、12、24h二、細三、TranswellTranswell是一種應用Transwell小室來探究細胞共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等的問題的實驗技術(shù)。三、TranswellTranswell是一種應三、Transwell①Transwell小室：常用8.0um膜，鋪膠130rmb、不鋪膠40rmb，可重復利用②上層培養(yǎng)液：無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2%BSA③細胞：有侵襲能力細胞先撤血清讓細胞饑餓12－24h，再進行實驗材料準備及說明：三、Transwell①Transwell小室：常用8.0u三、Transwell④基質(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel⑤下層培養(yǎng)液：含5%－10%FBS的培養(yǎng)基，也可用趨化因子⑥細胞培養(yǎng)板：6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用材料準備及說明：三、Transwell④基質(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料三、Transwell1.Transwell小室制備①包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干②水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。三、Transwell1.Transwell小室制備三、Transwell2.取細胞懸液加入Transwell小室，24孔板小室一般200μl。細胞密度為1－10×105個.3.24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。三、Transwell2.取細胞懸液加入Transwell小三、細胞劃痕實驗4.培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)48h，具體調(diào)整5.結(jié)果測定：①直接測定：細胞染色，鏡下計數(shù)②間接測定：MTT法、熒光試劑檢測、結(jié)晶紫染色問：某藥可抑細胞侵襲，24h后可抑制細胞增殖，可以培養(yǎng)36h看結(jié)果嗎？三、細胞劃痕實驗4.培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)48h，具體調(diào)整5.結(jié)三、Transwell直接觀察：①用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞②染色：推薦采用0.1%結(jié)晶紫固定染色。③細胞計數(shù)：把小室反過來直接觀察或把膜切下直接染色，取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)問：①、②先后問題？三、Transwell直接觀察：問：①、②先后問題？三、Transwell間接觀察：結(jié)晶紫法①用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞②染色：推薦采用0.1%結(jié)晶紫固定染色。③染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm測其OD值，間接反映細胞數(shù)。三、Transwell間接觀察：結(jié)晶紫法四、裸鼠尾巴靜脈注射小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型分類：1.人工轉(zhuǎn)移模型：將腫瘤細胞體外培養(yǎng)株或腹水等行注射，在肺(尾靜脈注射)、腦(頸動脈注射）肝臟(肝動脈注射）等部位觀察2.自發(fā)轉(zhuǎn)移模型：腫瘤細胞接種在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原組織中，觀察轉(zhuǎn)移灶。四、裸鼠尾巴靜脈注射小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型分類：四、裸鼠尾巴靜脈注射1.裸鼠的選擇：4-6周裸鼠、價格約100+rmb2.細胞的選擇：查閱文獻，選擇合適細胞株；細胞濃度：具體不定，動物腫瘤一般接種2～600萬/只就100%成瘤，而人癌則需要1000萬以上才能較高的成瘤四、裸鼠尾巴靜脈注射1.裸鼠的選擇：4-6周裸鼠、價格約10四、裸鼠尾巴靜脈注射3.注射技巧：①固定：50ml離心管自制或購買成品②注射位置：鼠尾部側(cè)面的2條靜脈，一般在尾部遠端的1/3到1/2處進針。③注射：選擇1-2ml注射器，針頭采用4號或4.5號。④凸顯靜脈：溫水，烤燈等四、裸鼠尾巴靜脈注射3.注射技巧：四、裸鼠尾巴靜脈注射問：如何判斷已經(jīng)注射進入：注射到靜脈的推液幾乎沒有阻力，可快速將液體推完通常600ul可在10秒推完。如果注射到靜脈以外，強行推液，阻力較大，注射處周圍會出現(xiàn)露水樣滲液，而且出針后，出血較少。并且由于藥液瘀阻在尾部，導致血流不暢，尾部缺血，易導致尾部炎癥和壞死。四、裸