實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理及應(yīng)用課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司張達(dá)威實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司張達(dá)威1主要內(nèi)容熒光定量PCR原理熒光定量PCR方法與應(yīng)用主要內(nèi)容熒光定量PCR原理2熒光定量PCR定義

在PCR反應(yīng)體系中，加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積對(duì)PCR反應(yīng)過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)控，最終對(duì)初始模板進(jìn)行定量。熒光定量PCR定義3傳統(tǒng)PCR定量與實(shí)時(shí)定量PCR

傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點(diǎn)法的檢測(cè)：

動(dòng)態(tài)范圍受限檢測(cè)重現(xiàn)性極差

實(shí)時(shí)定量PCR依靠熒光信號(hào)的擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)：

靈敏度高重復(fù)性好動(dòng)態(tài)范圍寬高通量傳統(tǒng)PCR定量與實(shí)時(shí)定量PCR傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點(diǎn)法4Gel-basedquantification11,500counts/5200counts=2.2folddifferenceGel-basedquantification11,5005Real-timequantificationCt18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifferenceReal-timequantificationCt186Ct終點(diǎn)檢測(cè)重復(fù)性好精確度高誤差小傳統(tǒng)PCR與實(shí)時(shí)定量PCRCt終點(diǎn)檢測(cè)重復(fù)性好傳統(tǒng)PCR與實(shí)時(shí)定量PCR7閾值threshold：在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，在擴(kuò)增曲線任意位置上人為設(shè)定的一個(gè)值，一般我們將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT=cyclethreshold即閾值循環(huán)數(shù)：熒光信號(hào)達(dá)到閾值設(shè)定值時(shí)PCR所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值與CT值閾值threshold：在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，在擴(kuò)增曲線8檢測(cè)極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresholdC(t)值與閾值檢測(cè)極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresho9熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對(duì)數(shù)與C(t)值成反比熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對(duì)數(shù)與C(t)值成反比10如何定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)樣本C(t)值定量如何定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線11標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的Ct值，依據(jù)Log起始拷貝量與Ct的線性關(guān)系，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線12熒光定量PCR方法熒光染料法熒光探針?lè)晒舛縋CR方法熒光染料法13SYBRGreenI?

TaqMan?MolecularBeaconsDNAbindingProbebaseddetectionTaqTaq染料和探針SYBRGreenI?

DNAbindingProbe14SYBRGreen:最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm

染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，單鏈不結(jié)合游離時(shí)熒光信號(hào)非常低，結(jié)合后熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)1000倍

不能區(qū)分引物二聚體，單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)，非特異性產(chǎn)物需要做熔解曲線分析產(chǎn)物的單一性SYBRgreen是一個(gè)很好的初級(jí)化學(xué)試劑，價(jià)格上存在優(yōu)勢(shì)，在試驗(yàn)驗(yàn)證和問(wèn)題分析上非常有用。SYBRGreen法作用機(jī)理SYBRGreen:SYBRgreen是一個(gè)很好的初級(jí)15熔解曲線分析單一峰，無(wú)非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異性產(chǎn)物，定量不準(zhǔn)確熔解曲線分析單一峰，無(wú)非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異16unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特點(diǎn)：

特異性高：只有引物和探針都和同一模板結(jié)合時(shí)才能檢測(cè)完全實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：一分子熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)一條DNA鏈的產(chǎn)生多通道檢測(cè)：可以在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同目的基因序列Taqman探針?lè)═aqman探針：是與目的序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸，5‘端標(biāo)記熒光報(bào)告集團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅集團(tuán)，探針完整時(shí)不發(fā)出熒光，水解后發(fā)出熒光。unboundprobe

freeinsolution17HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道實(shí)驗(yàn)DanielCandotti-Cambridge,UKHCV(FAM)HIV-1(HEX)HBV(CY518絕對(duì)定量相對(duì)定量SNP分析實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用絕對(duì)定量實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用19應(yīng)用之一：病原體檢測(cè)與定量絕對(duì)定量（檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)－病原體的多少）標(biāo)準(zhǔn)品（如質(zhì)粒）：做系列梯度稀釋待測(cè)樣本陰性對(duì)照（NTC）應(yīng)用之一：病原體檢測(cè)與定量絕對(duì)定量（檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝20應(yīng)用之一：病原體檢測(cè)與定量1432應(yīng)用之一：病原體檢測(cè)與定量143221應(yīng)用之一：病原體檢測(cè)與定量應(yīng)用之一：病原體檢測(cè)與定量22應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析相對(duì)定量：基因表達(dá)量上升或者表達(dá)被抑止的倍數(shù)兩種樣品：Calibrator（對(duì)照，如正常組織）與Sample（待測(cè)樣品）兩個(gè)基因：目的基因與看家基因應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析相對(duì)定量：基因表達(dá)量上升或者表達(dá)被23Normalizer看家基因應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCt

Ct1

Ct2Normalizer應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析Calibra24應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異＝2

/2

Ct1

Ct2＝2

Ct1-

Ct2應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異＝2/225應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)物系列稀釋兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)26應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析1234應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析123427

應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析28兩條探針?lè)謩e針對(duì)不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP分析兩條探針?lè)謩e針對(duì)不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP29應(yīng)用之三：SNP分析FAMTETFAMTET12應(yīng)用之三：SNP分析FAMTETFAMTET1230應(yīng)用之三：SNP分析21應(yīng)用之三：SNP分析2131Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！32試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化PCR是精確性很高的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前我們需要完整的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，而且實(shí)驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果影響也很大。PCR擴(kuò)增效率：保證實(shí)驗(yàn)的精確性和重復(fù)性。影響擴(kuò)增效率的因素：擴(kuò)增子長(zhǎng)度；擴(kuò)增子GC含量；擴(kuò)增子、引物、探針二級(jí)結(jié)構(gòu)；PCR各組分反應(yīng)濃度；模板濃度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化PCR是精確性很高的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前我們需要完整的33引物設(shè)計(jì)原則擴(kuò)增片段100-200bp引物長(zhǎng)度18-30bp，Tm在58-62℃之間，上下游引物Tm值不超過(guò)2℃GC含量在30-80%，避免出現(xiàn)多個(gè)重復(fù)堿基，3’端不為G或C。避免引物內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物間二聚體出現(xiàn)?？缤怙@子設(shè)計(jì)引物，消除基因組DNA擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)原則擴(kuò)增片段100-200bp34探針設(shè)計(jì)原則Taqman探針長(zhǎng)度25-32bp，Tm在68-72℃之間，確保比引物的Tm值大5-10℃GC含量在30-80%，避免出現(xiàn)多個(gè)重復(fù)堿基5’端不能為G，G能淬滅熒光信號(hào)Taqman探針要靠近上游引物，最好只有一個(gè)堿基距離。避免探針與引物間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)SNP位點(diǎn)應(yīng)設(shè)計(jì)在探針中間位置探針設(shè)計(jì)原則Taqman探針長(zhǎng)度25-32bp，Tm在68-35實(shí)時(shí)PCR體系優(yōu)化基本參數(shù)的優(yōu)化MgCl2的濃度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板濃度，系列稀釋梯度模板，CP在15-30之間。而CP值的確定經(jīng)驗(yàn)上是SYBRGreen熒光信號(hào)是本底的2倍，雜交探針熒光強(qiáng)度是本底的0.3倍。實(shí)時(shí)PCR體系優(yōu)化基本參數(shù)的優(yōu)化36使用SYBRGreen測(cè)定DNA的優(yōu)化MgCl2的濃度，2-4mM模板濃度，DNA：50ng-5pg；質(zhì)粒：106拷貝引物濃度，0.3uM退火濃度，比計(jì)算出的Tm小5℃使用SYBRGreen測(cè)定DNA的優(yōu)化37使用SYBRGreen進(jìn)行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化MgCl2的濃度，4-8mM模板濃度，總RNA或mRNA：1pg-1ug使用SYBRGreen進(jìn)行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化38雜交探針測(cè)定DNAMgCl2的濃度，不要超過(guò)2mM探針濃度，0.2uM雜交探針測(cè)定DNA39雜交探針進(jìn)行實(shí)施定量RT-PCRMgCl2的濃度，4-8mM之間探針濃度，0.2uM模板濃度設(shè)置，1pg-1ug的總RNA或是mRNA雜交探針進(jìn)行實(shí)施定量RT-PCR40熒光定量PCR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)－加熱、制冷樣品檢測(cè)設(shè)備熒光定量PCR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)－加熱、制冷樣41熒光定量PCR儀應(yīng)滿足的要求光源的光譜范圍寬廣，能激發(fā)不同的熒光染料能分開(kāi)不同熒光素的激發(fā)光與發(fā)射光波長(zhǎng)能檢測(cè)的靈敏度與動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍準(zhǔn)確的溫度控制和良好的孔間溫度均一性.熒光定量PCR儀應(yīng)滿足的要求光源的光譜范圍寬廣，能激發(fā)不同的42

Stratagene公司成立于1984年,致力于發(fā)展生命科學(xué)領(lǐng)域的創(chuàng)新產(chǎn)品與科技.總部位于美國(guó)LaJolla,California.在歐洲與日本設(shè)有分公司.2007年被Agilent公司收購(gòu)，成為Agilent公司旗下品牌。Stratagene公司簡(jiǎn)介Stratagene公司成立于1984年,致力43Mx3000P整體設(shè)計(jì)熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)射光濾鏡輪激發(fā)光濾鏡輪光纖掃描臂Mx3000P整體設(shè)計(jì)熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)射光濾鏡輪44儀器優(yōu)勢(shì)

石英鹵鎢燈的激發(fā)光源：超長(zhǎng)的激發(fā)光范圍350-750nm多通道設(shè)計(jì)，濾光片可靈活定制卓越的孔間均一性和溫度控制，