DB36T 1799-2023 茶樹菇菌種鑒定技術規(guī)程

ICS65.020.20CCSB30

DB36發(fā)布發(fā)布江西省市場監(jiān)督管理局2024010120230701江 西 省 地 方 標 準DB36/T1799—2023茶樹菇菌種鑒定技術規(guī)程TechnicalregulationsofidentificationforCyclocybeaegeritaspawnDB36/T1799DB36/T1799—2023DB36/T1799DB36/T1799—2023II目??次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1試劑和儀器 2鑒定方法 2附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基制備 7附錄B（規(guī)范性）試劑及其制備 8附錄C（資料性）儀器 11附錄D（規(guī)范性）拮抗反應類型 12附錄E（資料性）試驗用引物參照 13IIII前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江西省農業(yè)農村廳提出并歸口。本文件起草單位：江西省農業(yè)科學院農業(yè)應用微生物研究所、江西省農業(yè)技術推廣中心。本文件主要起草人：王洪秀、魏云輝、龔正、胡佳、馮艷、孫鵬、陳緒濤、袁夢涵。茶樹菇菌種鑒定技術規(guī)程范圍本文件規(guī)定了茶樹菇菌種鑒定的過程，包括試劑和儀器、樣品制備、試驗步驟、試驗數據處理等內容。本文件適用于江西省茶樹菇菌種鑒定。規(guī)范性引用文件NY/T1097食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法NY/T1730食用菌菌種真實性鑒定ISSR法NY/T1845食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應術語和定義NY/T1845、NY/T1097和NY/T1730界定的以及下列術語和定義適用于本文件。茶樹菇Cyclocybeaegerita茶樹菇Cyclocybeaegerita隸屬于真菌界FungiKingdom、擔子菌門Basidiomycota、傘菌綱AgaricomycetesAgaricomycetidaeAgaricalesTubariaceaeCyclocybe，菌種區(qū)別性distinctnessofspawn供檢菌種和對照菌種的不符合性。[NY/T1845，定義3.1]隆起型ridgy對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現特征之一，表現為兩菌株菌落交界處菌絲隆起。1[NY/T1845，定義3.2]溝壑型chimb色線型colorbar對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現特征之一，表現為兩菌株菌落交界處形成一條色素分界線。隔離型dividingline對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現特征之一，表現為兩菌株菌落交界出現一條無菌絲的帶狀分隔區(qū)。菌種真實性genuinenessofspawn供檢菌種和對照菌種的符合性。[NY/T1097，定義3.1]對峙培養(yǎng)法face-offculture酯酶同工酶法esteraseisoenzymemethodISSR法intersimplesequencerepeattechnique以錨定微衛(wèi)星DNA為引物，對基因組DNA進行PCR擴增，得到與錨定引物互補的重復序列的區(qū)間DNA片段。不同物種基因組DNA中的這種反相重復的微衛(wèi)星序列的數目和間隔的長短不同，就可導致PCRPCR產物的檢測和比較，即可識別茶樹菇菌種基因組DNA的多態(tài)片段，從而鑒定菌種的真實性。233在通風、避光、溫度為25℃條件下培養(yǎng)至接種塊菌絲接觸，需20d～25d。5.1.5 判定規(guī)則D。酯酶同工酶法液體培養(yǎng)直接將接種塊接入三角瓶液體培養(yǎng)基中，25℃，180rpm振蕩避光培養(yǎng)20d。培養(yǎng)基的制備參見附錄A.2。酯酶同工酶樣品制備3份。稱取菌絲體0.5g于1.5mL離心管中，放入冷凍干燥機中低溫冷凍干燥24h。向每個裝樣品的離心管中加入小鋼珠并將離心管放入組織研磨儀中，60Hz下研磨30s成細粉末，加入0.5mL樣品提取液（附錄B.1）。將研磨后的樣品在4℃下1200010比例混勻，混合液即為電泳樣品。5.2.3 凝膠制備試劑和儀器培養(yǎng)基制備及試劑要求按照附錄A和附錄B執(zhí)行，儀器按照附錄C準備。鑒定方法對峙培養(yǎng)法菌絲體培養(yǎng)供檢茶樹菇菌株與對照菌株在相同條件下培養(yǎng)，將固體菌種從試管斜面接種到直徑90mm固體PDA平板上，25℃避光培養(yǎng)15d。接種組合與重復次數茶樹菇供檢菌株與對照菌株的拮抗反應接種組合為33接種操作嚴格按無菌操作，用單孔直徑5mm打孔器分別打取活化后適齡的茶樹菇供檢菌株與對照菌株菌落邊緣做接種塊，菌絲朝上，兩接種塊間隔30mm，置于平板中心位置。培養(yǎng)條件分離膠分離膠濃度7.5%（B.3）:（B.5）:雙蒸水:（附B.2）=2:5:1:80.1%的cm，加入適量的水封住膠面，待凝膠聚合后將水吸出。濃縮膠濃縮膠濃度（（雙蒸水:（附錄B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入膠溶液體積0.1%的TEMED，充分混勻，灌入膠室，立即插入樣品梳，待凝膠。點樣（附15μL～20μL樣品加入點樣孔。電泳將電泳槽放入冰箱內進行低溫電泳，采用穩(wěn)壓電泳，電壓為130V，待指示劑進入分離膠后，電壓升至260V。待前沿指示劑距膠底部約1cm～1.5cm，停止電泳。取膠染色（附錄℃1520min，用水沖洗干凈后置乙酸溶液（B.10）中固定。遷移率Rf值計算應按照NY/T1097的規(guī)定執(zhí)行。判定規(guī)則ISSRDNA模板的制備30.2g30.5g1.5mL24h。向每個裝樣品的離心管中加入小鋼珠并將離心管放入組織研磨儀中，60Hz30s成細650μL656540min～60不時輕輕地搖動混勻。12000rpm10min1.5mL離心管中，棄沉淀。4加入等體積的酚-氯仿-（附錄℃rpm151.5mL離心管中，棄下層有機相。加入等體積的氯仿（附錄B.15）℃，12000rpm15min1.5mL離心管中，棄下層有機相。260min，10000rpm10min，棄上清液。70%（2DNA。100μLTE（附錄2μL℃812h。DNATE（B.18）300μL5MNaCl（附錄B.19）50μL，CTAB純化緩沖液（附錄B.14）40μL，65℃10min。3.6.2.43.6.2.53.6.2.6DNA，-20℃復凍融使用。DNA質量的檢測凝膠電泳檢測凝膠成像5μL1μL0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。篩選判定與DNA分子量標記比較，觀察所提取的基因組DNA質量及片段大小，按下列標準判定：DNA樣品，可用于鑒定；DNA樣品，不建議用于鑒定；DNA樣品，不可用于鑒定。A260/A280OD值檢測DNA1μLDNAA260/A280的ODOD260值相當于50μg/mLDNADNADNAOD260/OD2801.7～2.0之間。依據測得的質量濃度將DNA溶液稀釋到25ng/μL～50ng/μL，-20℃保存。ISSR擴增引物引物見附錄E。如果必要可以篩選新的引物。反應體系566觀察空白對照的凝膠成像照片，按下列結果判斷：3個平行試驗結果一致，則本次試驗結果可以使用；PCR空白對照中擴增出了片段，則說明檢測過程中發(fā)生了污染，需查找原因重新檢測。5.3.7 判定規(guī)則PCR1，可判PCR產物一致，再增加引物個數，進行檢測驗證。必要時可以增加其他方法佐證。PCR202PCRPremix10μLPrimer10μmol/L1μLDNA1μLddH2O8μL0.2mLPCRPCR擴增。設置PCR空白對照。反應條件PCR擴增儀上進行以下循環(huán)：943min9430s，55℃45s，72延伸2min，共35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測（1.8%50℃～60℃緩沖液（附錄B.21）的電泳槽中。PCRDNA分子量標記，接5V/cm1cm左右停止電泳。數據記錄電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像。根據DNA分子量標記判斷擴增出的目的條帶的大小，將電泳結果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。PCR擴增產物質量判斷77附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基制備固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g（用浸出汁），葡萄糖20g，瓊脂20g，去離子水或相當純度的水1000mL，pH自然。液體培養(yǎng)基（PDB）：200g新鮮馬鈴薯，20g葡萄糖，加去離子水或相當純度的水補齊至1000mL，pH自然。100mL三角瓶裝50mL左右。886.0g28.8g1L，使用時稀釋10倍，使用液pH8.3。B.8 磷酸緩沖液10.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、2.0g甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃貯存。B.7 酯酶同工酶電極緩沖液28.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、0.735g甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis），溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃貯存。B.6 濃縮膠母液5.98g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）48mL1mol/LHCL溶解，TEMED0.46mL，定容至100mL，4℃貯存。B.5 分離膠母液B.4 濃縮膠緩沖液（pH6.7）附錄B（規(guī)范性）除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑和去離子水或相當純度的水。樣品提取液（pH7.5）6.02g（Na2HPO4·12H2O）0.50g（NaH2PO4·2H2O）100mL。過硫酸銨(1.4g/L)稱取0.14g過硫酸銨溶于水中，定容至100mL，現用現配。分離膠緩沖液（pH8.9）36.3g48mL1mol/LHCL0.23mL，100mL，4℃貯存。9970mL100mL。25:24:1的體積比進行配制，4℃B.17 70 乙醇溶液24:14℃B.16 酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）4.1gNaCl80ml10gCTAB，55℃100mlB.15 氯仿-異戊醇（24:1）16.364g70mL4g溴代十六烷基三甲胺（CTAB），完全溶20mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)8mL0.5mol/LEDTApH1000.1%的β-巰基乙醇。B.14 CTAB37.22g（EDTA-Na·2H2O）160mLNaOH調節(jié)溶液的pH至8.0，然后定容至200mL，高壓滅菌。B.13 2 CTAB22.6g（Na2HPO4·12H2O）21.4g（NaH2PO4·2H2O）1L。酯酶同工酶染色液0.1g乙酸-1-萘酯、0.1g乙酸-2-萘酯、0.2gRR10mL丙酮溶解，再加入磷酸緩300mL，過濾，現用現配。乙酸溶液70mL/L。量取14mL乙酸，加到適量水中，并稀釋至200mL。1mol/LTris-HCl(pH8.0)12.11g80mLpH8.0100mL，高壓滅菌。B.12 0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-2Na)溶液(pH8.0)1010B.26 無水乙醇B.25 DNADNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑。B.24 核酸染料4×ProteinNativePAGELoadingBuffer。B.23 PCRPremixTE在80mL水中依次加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL，加水定容至100mL，高壓滅菌。5MNaCl稱取292.5gNaCl，溶解于水中，稀釋到1L。50×TAETris242.2g300mL100mL0.5mol/LEDTA的水溶解(pH8.0)，pH8.01L。1×TAE取20mL50×TAE，ddH2O定容至1L。室溫保存。酯酶同工酶上樣緩沖液1111LED觀片燈微量進樣器C.15 凝膠成像系統(tǒng)C.14 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀PCR擴增儀水平板電泳槽垂直板電泳槽：凝膠面積（W×L）160×180mm電熱恒溫水浴槽：精度±0.1微量核酸檢測儀附錄C（資料性）儀器生化恒溫培養(yǎng)箱：精度±0.1分析天平：感量0.01g、0.0001g各一臺打孔器：單孔直徑5mm高壓滅菌鍋冷凍干燥機組織研磨儀高速冷凍離心機（10000rpm以上）全溫搖瓶柜：精度±0.1附錄D（規(guī)范性）A BD EＡ：隆起型；Ｂ：溝型；Ｃ：隔離型；D：色線型；E：箭頭所示菌株間無拮抗121313附錄E（資料性）表E.1