正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)課件

口服胰島素腸溶膠囊的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)口服胰島素腸溶膠囊的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)1一、高胰島素--正葡萄糖鉗夾技術(shù)一、高胰島素--正葡萄糖鉗夾技術(shù)2（一）、歷史背景

1966年Andres等根據(jù)葡萄糖一胰島素的負(fù)反饋原理，創(chuàng)立了一種可定量分析胰島素分泌及作用的方法——葡萄糖鉗夾技術(shù)。1979年DeFronzo等對(duì)該技術(shù)從理論上作了詳細(xì)的闡述，并給予技術(shù)指導(dǎo)，推動(dòng)了世界范圍的廣泛應(yīng)用。萄糖鉗夾技術(shù)根據(jù)研究目的的不同又劃分為高糖鉗、正糖鉗及低糖鉗等不同方法。（二）、技術(shù)原理1、葡萄糖一胰島素負(fù)反饋體系

血糖升高時(shí)，胰島素分泌增加，并通過(guò)增加攝取、儲(chǔ)存和利用葡萄糖等方式，下調(diào)血糖；血糖下降，胰島素分泌降低，胰高血糖素等升糖激素增加，促進(jìn)代謝分解，加速糖原分解和葡萄糖異生作用，升高血糖。（一）、歷史背景32、鉗夾技術(shù)原理正糖鉗技術(shù)通過(guò)同時(shí)輸注可控濃度及速率的外源性胰島素和葡萄糖，打破體內(nèi)葡萄糖一胰島素的負(fù)反饋調(diào)控，使血漿外源性胰島素維持在較高濃度水平，而血糖維持在基礎(chǔ)穩(wěn)態(tài)水平。由于血漿外源性胰島素的優(yōu)勢(shì)濃度，抑制了內(nèi)源性葡萄糖(肝糖分解和糖異生)和內(nèi)源性胰島素分泌，此時(shí)外源性葡萄糖輸注速率等于外周組織的葡萄糖利用率，從而評(píng)價(jià)葡萄糖、胰島素以及其他相關(guān)物質(zhì)的代謝過(guò)程。2、鉗夾技術(shù)原理4（三）、特點(diǎn)1、避免了內(nèi)源性胰島素缺乏(如糖尿病患者)及低血糖(如胰島素耐量試驗(yàn)中)對(duì)胰島素敏感性測(cè)定的影響。2、將內(nèi)源性干擾減至最小，增加了實(shí)驗(yàn)的可控性與準(zhǔn)確性，降低了結(jié)果的變異性。（四）、缺點(diǎn)1、不同受試者的應(yīng)激反應(yīng)和血管緊張度等諸多因素會(huì)對(duì)穩(wěn)態(tài)的建立產(chǎn)生一定的影響。2、該技術(shù)復(fù)雜耗時(shí)、費(fèi)用昂貴，實(shí)驗(yàn)中需頻繁取血。（五）、實(shí)驗(yàn)方法1、建立靜脈輸液通道及采血通道在前臂靜脈或正中靜脈穿刺并留置導(dǎo)管建立輸液通道，用于輸入胰島素和葡萄糖溶液。葡萄糖和胰島素輸注通道經(jīng)三通管與靜脈通道聯(lián)接。采血通道由輸液器、三通管、帶延長(zhǎng)的三通管、靜脈留置針依次串連在一起，2個(gè)三通管的側(cè)孔分別接上注射器，并保持管道通暢。（三）、特點(diǎn)52、鉗夾實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)前比格犬禁食12h，試驗(yàn)時(shí)用巴甫洛夫吊帶將比格犬固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。在動(dòng)物一側(cè)前肢建立靜脈通道，該通道連接三通管，一端連接胰島素注射泵，一端連接葡萄糖輸注泵。鉗夾開(kāi)始后10min內(nèi)以較快的速度輸注胰島素，以使血胰島素水平快速升高，而后以較低的速度持續(xù)輸注維持一定血胰島素濃度。在靜脈通道對(duì)側(cè)前肢取血測(cè)量血糖，每隔5min取血測(cè)量血糖一次，通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖輸注率以維持血糖水平恒定。經(jīng)一段時(shí)間后、血糖恒定維持于平衡狀態(tài)。給胰島素制劑后,葡萄糖輸注率隨著胰島素產(chǎn)生的作用變化，以此來(lái)評(píng)價(jià)胰島素制劑的藥效動(dòng)力學(xué)特征。2、鉗夾實(shí)驗(yàn)63、正糖鉗技術(shù)指標(biāo)①鉗夾穩(wěn)定狀態(tài)下血糖(SSPG)：SSPG需控制在正常空腹血糖±10％范圍內(nèi)。②鉗夾穩(wěn)定狀態(tài)下胰島素(SSINS)：較高的血漿外源性胰島素水平才能抑制內(nèi)源性肝糖及胰島素的生成，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。③血糖變異系數(shù)(CVBG)：鉗夾實(shí)驗(yàn)期間CVBG可反映鉗夾技術(shù)的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。④穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注速率(SSGIR)：SSGIR等于外周組織的葡萄糖利用率，可用來(lái)評(píng)價(jià)外周組織(主要是肌肉組織)胰島素作用，反映機(jī)體組織的胰島素敏感性。⑤內(nèi)源性胰島素分泌：c肽水平可評(píng)估內(nèi)源性胰島素分泌，粗略判斷內(nèi)源性胰島素分泌的抑制程度。3、正糖鉗技術(shù)指標(biāo)7二、RIA方法測(cè)定血清樣品中胰島素抗原濃度二、RIA方法測(cè)定血清樣品中胰島素抗原濃度8（一）原理將一定量的胰島素標(biāo)記示蹤物和待測(cè)樣品混合，加入豬胰島素抗體,通過(guò)標(biāo)記示蹤物和待測(cè)樣品與抗體的特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。加入沉淀劑后,與抗體結(jié)合的標(biāo)記示蹤物在沉淀中，結(jié)合的標(biāo)記示蹤物與待測(cè)胰島素樣品的量成反比。γ計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)越高，對(duì)應(yīng)的胰島素樣品的濃度越低。（二）實(shí)驗(yàn)方法1、采樣各組動(dòng)物于給予胰島素制劑前及給藥后每隔30min取血,直至鉗夾結(jié)束。全部血樣均于凝固后離心獲得血清，血清樣品于-20℃保存。采用RIA方法檢測(cè)其中的豬胰島素抗原濃度，用于胰島素血清藥代動(dòng)力學(xué)的計(jì)算。（一）原理92、測(cè)定NSB管(非特異性結(jié)合管)加300ml分析液，Bo管(參比管)加200ml分析液，其他管加100ml分析液。在其它分析管中加100oL標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控樣品或待測(cè)血清樣品，各管加入100μl125I-Insulin，然后各管(除Totalcount

tubes與NSB管)加入100ml豬胰島素抗體，混合均勻，封閉，4oC過(guò)夜。20小時(shí)以后各管加1ml的冷凍沉淀劑，渦旋，孵育20min，4oC。離心30min，立即傾出上清，于γ計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)各管。各批分別設(shè)置豬胰島素標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(xiàn)，用以計(jì)算該批所測(cè)未知樣品濃度。2、測(cè)定10（三）結(jié)果計(jì)算用MicroCal公司Origin5.0對(duì)濃度對(duì)數(shù)和各管放射計(jì)數(shù)與總計(jì)數(shù)的比值對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，四參數(shù)Logistic擬合：（四）PKPD參數(shù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析用MierosoftExee1XP軟件采用統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算各藥效動(dòng)力學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。PK或PD曲線(xiàn)下面積用梯形法進(jìn)行計(jì)算。達(dá)峰時(shí)間與峰濃度均為實(shí)測(cè)值。比格大自身交叉對(duì)照組數(shù)據(jù)比較用Student‘S配對(duì)t一檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)判斷,其它處理組組間t一檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)判斷。用Origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性回歸求回歸方程及相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)，并作圖。（三）結(jié)果計(jì)算（四）PKPD參數(shù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析11三、相關(guān)分析技術(shù)三、相關(guān)分析技術(shù)12（一）放射免疫分析(RIA)方法

放射免疫技術(shù)為一種將放射性同位素測(cè)量的高度靈敏性、精確性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的體外測(cè)定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定的技術(shù)，都可稱(chēng)為放射免疫技術(shù)，經(jīng)典的放射免疫技術(shù)是標(biāo)記抗原與未標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量的抗體，然后通過(guò)測(cè)定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中放射性強(qiáng)度的改變，測(cè)定出未標(biāo)記抗原量。它可以分為兩類(lèi)：競(jìng)爭(zhēng)性RIA和非競(jìng)爭(zhēng)性RIA，也稱(chēng)為免疫放射分析。（一）放射免疫分析(RIA)方法13（二）統(tǒng)計(jì)矩方法1、應(yīng)用藥物動(dòng)力學(xué)研究的統(tǒng)計(jì)矩分析，是一種非隔室的分析方法，它不需要對(duì)藥物設(shè)定專(zhuān)門(mén)的隔室，也不必考慮藥物的體內(nèi)隔室模型特征。2、目前這種分析方法主要適用于體內(nèi)過(guò)程符合線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)的藥物。（三）t一檢驗(yàn)