細(xì)胞自噬誘導(dǎo)實驗報告

細(xì)胞自噬誘導(dǎo)試驗報告1Real-timeTGTG5AT7G2Westernblotting分析LC3的脂化；3、構(gòu)建GFP-LC3表達(dá)載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用熒光顯微鏡觀看LC3顆粒的聚攏；4、制備電鏡樣品，直接觀看自噬體的形成。一、pEGFP-C2-LC3質(zhì)粒的提取與鑒定試驗原理一、試驗原理質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要覺察于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄力量,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依靠于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。,質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標(biāo)記基因如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列,,使分子量盡可能削減,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的關(guān)心序列,這些用途包DNADNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個抱負(fù)的克隆載體大致應(yīng)有以下一1〕2〕具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切〔3〕能插入較大的外源DNA〔4〕具有簡潔操作的檢測表型。煮沸法提取質(zhì)粒的原理DNA3DNA大量擴增；②DNADNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法和羥基磷灰石層析法等。TritonX-100水浴處理細(xì)胞，使宿主細(xì)胞細(xì)胞壁溶解、細(xì)胞膜破壞，蛋白質(zhì)與染色體DNA變性。而超螺旋構(gòu)造的質(zhì)粒DNA因構(gòu)造嚴(yán)密，雖然DNA配對雖被破壞，但雙鏈彼此不分開，當(dāng)溫度下降時恢復(fù)成超螺旋。當(dāng)溫度下降后，超螺旋質(zhì)粒DNA可重恢復(fù)其超螺旋構(gòu)造。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后通過異丙醇沉淀上清液中的DNA，從而回分別純化DNA。限制性內(nèi)切酶酶切鑒定質(zhì)粒的原理簡稱限制性核酸酶是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的是Ⅱ型限制性內(nèi)切酶在，它們是重組DNA的根底。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為46個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5”-G↓AATTC-3”),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時,會影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用的吸管頭。假設(shè)承受兩種限制性內(nèi)切酶,必需要留意分別供給各自的最適緩沖液和最適的溫度。瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖凝膠電泳通常承受水平電泳裝置，在強度和方向恒定的電場下進(jìn)展電泳。DNA分子在凝膠緩沖液〔一般為堿性〕中帶負(fù)電荷，在電場中由負(fù)極向正極遷移。DNA相對分子質(zhì)量越小，遷移越快、相對分子質(zhì)量越大，遷移越慢。DNA的構(gòu)象對遷移速度也有肯定的影響，向陽極遷移的速度超螺旋大于線狀，線狀大于開環(huán)。電壓在肯定的范圍，線狀DNA片段的遷移速率與所加的電壓成正比。為了使區(qū)分效果更好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm，因此，我們可以利用這些特性通過瓊脂糖凝膠電泳，區(qū)分不同相對分子質(zhì)量的DNA片段和質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳利用低濃度的熒光嵌入染料-溴化乙錠進(jìn)展染色。溴化乙錠含有一個可以嵌入DNA積存堿基之間的一個三環(huán)平面基團(tuán)，它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠〔0.5ug/ml〕時，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。DNA吸取254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸取 302nm和366nm的光輻射。這兩種狀況下，被吸取的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重放射出來。因此可在紫外光激發(fā)下觀看DNA在凝膠中的位置。溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸〔DNA或RNA。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產(chǎn)率也相對較低。事實上大多數(shù)對單鏈DNA或RNA染色的熒光時通過染料結(jié)合到分子內(nèi)形成較短的鏈內(nèi)螺旋產(chǎn)生的。二、 試驗?zāi)康模篋NA分別，純化的原理學(xué)習(xí)煮沸法快速提取質(zhì)粒DNA的方法學(xué)習(xí)DNA的限制性酶切的根本技術(shù)學(xué)習(xí)利用瓊脂糖電泳測定DNA片段的長度提取并酶切鑒定pEGFP-C3-LC3質(zhì)粒三、 試驗材料、試劑、儀器：菌種：E.coli DH5α〔pEGFP-C2-LC3質(zhì)?！吃噭孩臠B液體培育基(Luria-Bertani)(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g800mlNaOHpH7.5,1升,高壓20分鐘。⑵卡那霉素(kanamycin，kana)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?0mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mg/ml,并分裝成小份(1.5ml)保存于-20℃。⑷3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml40.81gNaAc·3H2O,pH5.2,加水定100ml,分裝后高壓滅菌,4℃冰箱。⑸STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。⑹STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。⑺電泳所用試劑：TAE緩沖液(50×)1L50×TAE緩沖液各成分用量：Tris堿242g〕冰乙酸〔57.1ml、EDTA200ml的0.5mol/LEDT〔pH8.0、水〔補足1〕。上樣緩沖液(6×)：0.25%溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液。⑻溴化乙錠(EB):11.0g200ml100ml，充分?jǐn)嚢钄?shù)小時完全溶解溴化乙錠。將溶液轉(zhuǎn)入棕色瓶，室溫避光保存。溴化乙錠最終工作濃0.5μg/ml。⑼限制性內(nèi)切酶:EcoRI酶及其酶切緩沖液:BamHI酶及其酶切緩沖液儀器：微量取液器、臺式高速離心機、恒溫振蕩搖床、高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器、電泳儀、瓊脂糖平板電泳裝置、恒溫水浴鍋等、紫外分光光度計。四、試驗步驟：Amp〕中，37℃12-16小時。煮沸法提取質(zhì)粒1.5mleppendorf管中,412023ｇ30秒。⑵棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。800ulSTET溶液中,渦旋混勻。200ul配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),3秒鐘。eppendorf管放入沸水浴中,1min秒后馬上取出。412023g30分鐘。⑺用200ul的槍吸出上清，參加1m〔1:8:1水：異丙醇：3MNaA。412023g20分鐘。⑼70%的乙醇清洗，12023g5分鐘。50ul三蒸水溶解。3.瓊脂糖凝膠電泳50×TAE20ml1000ml,1×TAE稀釋緩沖液，待用。0.4g200ml40ml1×TAE稀釋緩沖液，微波爐加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻。將制膠槽水平放置，插上樣品梳。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中參加溴化乙錠(EB)0.5μg/ml(EB參加凝膠中,0.5μg/mlEB溶液浸泡染色)。待膠完全凝固后撥出梳子,留意不要損傷梳底部的凝膠。⑷加樣：將制好的凝膠放入電泳槽，向槽內(nèi)參加１×TAE稀釋緩沖液至液面恰好沒過凝膠。5ul1ul6×載樣液混勻，用微量移液槍留神參加樣品槽中。,合上電泳槽蓋,60-80V,40mA以上。2cm時,停頓電泳。EB0.5μg/mlEB溶液中,20-25分鐘。質(zhì)粒濃度純度檢測:DNAOD260/280的值。純的DNA1.81.8〔留意：OD260以及OD280的數(shù)值10以內(nèi)這樣的比值才牢靠。酶切鑒定20ul體系，3712〔留意不能酶切時間太長〕NEBNEBbuffer 2ulEcoRI酶 0.5ulBamHI酶 0.5ulddH2O 17ul20ul體系，3712〔留意不能酶切時間太長〕瓊脂糖凝膠電泳分析酶切鑒定結(jié)果1%瓊脂糖凝膠，DL2023marker二、RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR一、 試驗?zāi)康模豪脤崟r定量方法檢測前列腺癌細(xì)胞系LNCap中，蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的現(xiàn)象二、 試驗原理：自噬〔Macroautophagy〕是指在真核細(xì)胞中膜〔大局部表現(xiàn)為雙層膜，有時多層〕包裹局部胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體〔autophagosom〔eamphisome，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體〔autophagolysosome，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程。自噬在真核細(xì)胞中高度保守，對于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝平衡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞正常的生理功能具有格外重要的作用。最近，有文章說明，蛋白酶體抑制劑作為一種抗腫瘤藥物，能夠同時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的自噬現(xiàn)象。在真核細(xì)胞的自噬發(fā)生過程中，自噬體形成的時候會發(fā)生兩個類似于泛素化修ATG5ATG12ATG8〔LC3〕與磷脂酰乙醇胺相連接的過程。在這兩個過程中，ATG4、ATG5ATG7這三個基因的表達(dá)明PCR檢測這三個基因的表達(dá)水平來間接地檢測自噬發(fā)生的水平。TrizolRNA試驗原理：TRIzolRNARNA的完整性。參加氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異RNA的降解，RNase酶格外穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNARNase的又一污染源是取液器，依據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)展處理。DEPCRNAase酶，一般DEPC70%DEPC水浸泡過夜后才可以使用。RNAcDNA后才能穩(wěn)定并mRNA作為模板，Oligo(dT或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光實時定量〔R：定量R技術(shù)〔e，是指在PCRPCR進(jìn)程，最終PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量PCR的方法相應(yīng)的PCR反響中利用標(biāo)記熒光PCR反響DNA雙鏈后，放射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。PCRDNASYBRGreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法。本試驗承受熒光染料法，所用染料為SYBRGreenⅠ。與實時定量有關(guān)的幾個相關(guān)概念簡介如下：擴增曲線：為了更好的理解熒光定量PCR原理，我將用樣品擴增曲線來進(jìn)展說明。描述PCRPCR的擴增曲線實際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線〔如以下圖3中，XPCR循環(huán)數(shù)，Y－軸表示擴增反響的熒光值，與反響管中擴增產(chǎn)物的量有比例關(guān)系。PCR擴增曲線可以分成三〔基線期〔對數(shù)期〕和平臺期。在基線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法推斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)展定量分析。熒光閾值：我們一般把熒光PCR的前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號〔baseline，基線期擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的10倍〔機器自動設(shè)置〕Ct值。CCycle，tthresholdCt值就是在熒光PCR擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù).Ct值即到達(dá)熒光閾值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系〔數(shù)學(xué)推導(dǎo)過程省略拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響試驗數(shù)據(jù)Ct值的大小反響了起始模板也就cDNA的量，同時也就反響了mRNA的量，即目的基因的表達(dá)水平。三、 試驗材料：LNCap細(xì)胞系PBS，1640+10%FBS培育基，胰蛋白酶，TrizolUp，DEPC，DDH2O，氯仿，異丙醇，乙醇，transgene反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa實時定量試劑盒10μl、200μl；鋁制飯盒：2個雷公藤紅素〔，工作濃度M、Z〔，工作濃度〕黃芩苷元〔，工作濃度、桑色素〔，工作濃度〕ATG5ForwardPrimer、ATG5ReversePrimer四、 試驗步驟：第一天：第一天：接種細(xì)胞：細(xì)胞在大瓶中長滿后，棄去培育基，用PBS2遍〔留意：LNCap細(xì)胞貼壁不牢，不能沖洗，輕輕晃動培育瓶即可，棄去，參加4滴胰酶，晃動培育瓶使胰酶掩蓋整個瓶底，然后棄去胰酶。消化2、3分鐘后，輕輕拍打培育瓶即可看到細(xì)胞被消化下來。參加5ml培育基終止消化，并用吸管吹打使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。300-400ul2次，取平均值，即為細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度。225ml80-100萬個細(xì)胞，混勻后放入細(xì)胞培育24小時后，細(xì)胞即可貼壁用于后續(xù)試驗。處理試驗器具：0.1%DEPC8h，DEPC劇毒，使用時留意不要接觸到皮膚，在通風(fēng)櫥內(nèi)操作DEPC水浸泡搶頭、EP管，浸泡過夜其次天：其次天：取昨天接種的2瓶細(xì)胞，顯微鏡下觀看細(xì)胞貼壁是否完好。然后其中一瓶參加蛋白DMSO24小時第三天：DEPCEP12125minEDPC，倒凈水，放烘箱中烘干第三天：RNA提取：取昨天加藥的兩瓶細(xì)胞，棄去培育基，參加1mlTrizol，水平放置片刻使裂解液均勻分布于細(xì)胞外表并裂解細(xì)胞，然后吹打使細(xì)胞脫落，轉(zhuǎn)移至EP管中，吹5min200ul氯仿/mlTrizol155min℃g離心。此時樣品分為三層，無色的水相〔上，中間層，粉紅色的有機相〔下。RNATrizol的一半EP0.5ml10min。10000g410min。取上清，在管低形成膠狀沉淀1ml75%乙醇，猛烈渦旋7) 7500g45min50-100ulDEPC10) 55-60℃10minRNA電泳〔甲醛變性電泳〕10×FABuffer500ml3.4gNaAc?3H2

O400mlDEPC水，溶解后220.9gMOPs1.86gEDTA2Na?2HO，溶解。用NaOHPH至27.0〔約用40m，定容至500m，避光保存。1×電泳緩沖液：20ml10×FAbuffer，4ml37%甲醛，176mlDEPC水50-60600ul0.2ulEB，倒入模具，待冷卻后使用2ul，加0.5ulloadingbuffer，80V電泳大約30min，紫外燈下檢測RNA條帶。RNA濃度RNAOD260/2801.8-20.之DNA污染。反轉(zhuǎn)錄RNARNA濃度調(diào)平，按下面體系配置然轉(zhuǎn)錄反響液：Components volumeTotalRNA 50ng-5ug〔300ng即可〕〔〔l〕 2×reactionmix 10ul酶 1ulDEPC水 補充至20ul配置好后，4230min855min，是反轉(zhuǎn)錄酶失活。實時定量將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍，用于實時定量反響。依據(jù)下面的體系配置反響液：Components volume〔10ul體系〕2×SYBR 5ulROXⅡ 0.2ulForwardPrimer 0.1ulReversePrimer 0.1ulH2O 3.6ulcDNA 1ul13ATG4b，AGT5，AGT7GAPDH4個基因的表達(dá)水平，每個基因?qū)?yīng)一對引物。試驗時，每對引物配置一個反響混合液，該混合液cDNA89ul，然后補1ulcDNA。留意8連管要在側(cè)壁上標(biāo)記好，不能在頂蓋上標(biāo)記。加好樣后，混勻，進(jìn)展實PCR反響。數(shù)據(jù)處理：溶解曲線：SYBRGreen二聚體在內(nèi)的任何dsDNA上，因此有必要區(qū)分目標(biāo)信號和假信號。內(nèi)嵌染料可以在反響末尾對擴增產(chǎn)物進(jìn)展溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點，實時儀器連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值。基于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進(jìn)展微分可以計算出溶解峰。溶解峰反映了反應(yīng)中擴增到的產(chǎn)物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。熔解曲線的設(shè)置是在整個PCR完成后進(jìn)展，從60℃升至95℃，每上升1℃儀器會自動收集熒光信號，得到的熔解曲線是漸漸下降的過程，且在Tm值下降最快，為便利分析，我們將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線，這樣我們就可以證明引物的特異性良好，試驗結(jié)果不受非特異性擴增和引物二聚體的干擾。相對定量qPCR據(jù)分析，一般常用的方法有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法、△Ct、2-△△Ct、用參照基因的△Ct法和Pfaffi法，應(yīng)用每種方法都有適應(yīng)條件。本試驗承受2-Ct法處理數(shù)據(jù)。舉例如下：6XGAPDHCt值后應(yīng)用GAPDH對為處理樣品和藥物處理樣品進(jìn)展矯正：ΔCt =XCt值-GAPDHCt值=26.52-20.34=6.18〔未處理樣品〕ΔCt =XCt值-GAPDHCt值=24.18-20.12=4.06〔藥物處理樣品〕然后，對未處理和經(jīng)過藥物處理的樣品ΔCt進(jìn)展歸一化：ΔΔCt=ΔCt -ΔCt =4.06-6.18=-2.12〔藥物處理樣品〕 〔未處理樣品〕ΔΔCtX基因的表達(dá)差異：2-ΔΔCt=2-〔-2.12〕=4.35因此藥物處理樣品的X基因表達(dá)水平是未處理樣品的4.35倍。三、觀看蛋白酶體抑制劑對自噬斑的誘導(dǎo)一、 試驗?zāi)康模河^看蛋白酶體抑制劑在前列腺癌細(xì)胞系LNCap中誘導(dǎo)自噬斑的狀況二、 試驗原理：LC3蛋白與LC3蛋白。利用構(gòu)建的外源質(zhì)粒共表達(dá)LC3蛋白和增加型增加型增加型綠色熒光蛋白EGF〔激發(fā)波長488nm530nLC3和EGFP白，這樣在自噬發(fā)生的時候連接著EGFP的LC3蛋白就會被招募到自噬體上去，在熒光顯平的凹凸。三、試驗材料：LC3-EGFPLNCaP細(xì)胞系PBS，1640+10%FBS培育基，胰蛋白酶移液器，滅菌槍頭雷公藤紅素〔，工作濃度M、黃芩苷元〔，工作濃度、桑色素〔200mM100uM〕第一天：四、 試驗方法：第一天：接種細(xì)胞：細(xì)胞在大瓶中長滿后，棄去培育基，用PBS2遍〔留意：LNCap細(xì)胞貼壁不牢，不能沖洗，輕輕晃動培育瓶即可，棄去，參加4滴胰酶，晃動培育瓶使胰酶掩蓋整個瓶底，然后棄去胰酶。消化2、3分鐘后，輕輕拍打培育瓶即可看到細(xì)胞被消化下來。參加5ml培育基終止消化，并用吸管吹打使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。300-400ul2次，取平均值，即為細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度。其次天：225ml80-10024小時后，細(xì)胞即可貼壁用于后續(xù)試驗。其次天：取昨天接種的2藤紅素〔或黃芩苷元或桑色素，工作濃度為M〔M或M，另一瓶DMSO最為比照。在不同時間點〔本試驗選取24h〕在熒光顯微鏡下觀看細(xì)胞內(nèi)自噬斑的形成狀況，拍照并統(tǒng)計細(xì)胞內(nèi)自噬斑的數(shù)目以及自噬斑陽性的細(xì)胞所占的百分比。自噬斑的數(shù)目統(tǒng)計遵循以下原則：隨機選取假設(shè)干個視野，只統(tǒng)計單細(xì)胞內(nèi)自噬5個的細(xì)胞內(nèi)的自噬斑的數(shù)目，單細(xì)胞內(nèi)自噬斑的數(shù)目多于20個時，該細(xì)胞算作自噬斑陽性的細(xì)胞。四、WesternBlot(WB)LC3的脂化LC3的脂化二、試驗原理Western免疫印跡W