分子熒光分析法經(jīng)典課件

*1572：西班牙植物學(xué)家N.Monardes觀察到熒光現(xiàn)象1855：Stokes研究熒光，提出作為一種分析手段1865：Goppelsroder首次應(yīng)用方法1886：提出熒與化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系的經(jīng)驗法則1968：Jette和West第一臺光電熒光計1956：第一臺商品化的熒光分光光度計特點：1)靈敏度高（1-100ppb)：有的可達(dá)0.01ppb；2)選擇性強；3)方法簡單快速，用樣量少;4)提供比較多的物理參數(shù)。

熒光分析的基本原理*特點：熒光分析的基本原理3.1熒光分析的基本原理*分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。熒光和磷光:

當(dāng)紫外光照射某些物質(zhì)時，由于這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊性，會發(fā)出比吸收波長更長的不同波長的可見光，當(dāng)紫外光照射停止時,隨之消失的光叫做熒光，不立即消失的光叫磷光。3.1熒光分析的基本原理*分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量3.1熒光分析的基本原理*分子能級=電子能級(Ee)+振動能級(Ev)+轉(zhuǎn)動能級(Er)。電子激發(fā)的多重度：M=2s+1Pauli不相容原理：分子中同一軌道所占據(jù)的兩個電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。單重態(tài):

如果分子中全部軌道里的電子都是自旋配對的,s=0,M=1三重態(tài)：電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，s=1,M=3S0S1S2T1T23.1.1分子發(fā)光的產(chǎn)生

3.1熒光分析的基本原理*分子能級=電子能級(Ee)+振動*去活化發(fā)射光子非輻射躍遷化學(xué)反應(yīng)熒光磷光振動馳豫系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換激發(fā)光去除后，熒光立即消失激發(fā)光去除后，磷光不會立即消失熄滅或猝滅3.1熒光分析的基本原理3.1.1分子發(fā)光的產(chǎn)生*去活化發(fā)射光子非輻射躍遷化學(xué)反應(yīng)熒光磷光振動馳豫系間跨越內(nèi)3.1.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

*激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）

激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)單色器3.1.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜*激發(fā)光譜:固定測量波長(選熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征*a.Stokes位移在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去轉(zhuǎn)動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。因此，在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)的更高振動能級，然而由于內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫的速率很快，很快損失多余的能量而衰變到S1電子態(tài)的最低振動能級盡管分子受激到達(dá)不同能級的激發(fā)態(tài)，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層，而與熒光體被激發(fā)至哪一個電子態(tài)無關(guān)。無論激發(fā)波長是λ1還是λ2，熒光的波長都是λ?23.1.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長也無關(guān)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征*a.Stokes位移3.1.2*

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(MAX)固定

ex=290nm(MAX)

em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1c.鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的各振動能級之間的躍遷和反躍遷幾率相等*ex=290nm(MAX)固定em=620nm(M*200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜*200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光*3.1.3熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率影響因素：熒光產(chǎn)生過程中，輻射和無輻射過程；與每一過程的速率常數(shù)有關(guān)；

kf

分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因）；主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。*3.1.3熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子*

n

振動弛豫激發(fā)

n熒光（1）躍遷類型：具有

電子躍遷類型的結(jié)構(gòu)

躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型較大的摩爾吸光系數(shù)較短的激發(fā)態(tài)壽命10-7~10-9s串越至三重態(tài)幾率小*振動弛豫激發(fā)熒光（1）躍遷類型：具有（2）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)*共軛度越大，熒光越強。原因：共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278322400480642

F0.110.290.460.600.52（2）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)*共軛度越大，熒光越強。化合物苯萘（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)

*0.9210.18（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)*0.9210.18*1）給電子取代劑加強熒光（4）取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光、強磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強度10182020202）吸電子取代基減弱熒光、加強磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光*1）給電子取代劑加強熒光（4）取代基效應(yīng)—HN2，—N*空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯強熒光物質(zhì)

F=0.75

F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)*空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯F=*含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強。（5）重原子取代基效應(yīng)—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強*含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強。（5）***3.1.4溶液的熒光強度1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系當(dāng)

lc

0.05*3.1.4溶液的熒光強度1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系當(dāng)*2影響熒光強度的環(huán)境因素1）溶劑對熒光強度的影響一般溶劑效應(yīng)介電常數(shù)、折射率特殊溶劑效應(yīng)溶劑與熒光物質(zhì)間的特殊作用溶劑相對介電常數(shù)熒光峰

/nm熒光效率乙腈38.24100.066丙酮21.34050.055氯仿5.53980.046四氯化碳2.243900.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率極性增加，熒光效率增加；粘度增加，熒光效率增加*2影響熒光強度的環(huán)境因素1）溶劑對熒光強度的影響一般溶劑*2影響熒光強度的因素2）溫度對熒光強度的影響隨著溫度的增高，熒光物質(zhì)溶液的熒光量子產(chǎn)率及熒光強度將降低不同溫度下鄰菲啰啉的

熒光光譜（在鄰二苯中）碰撞幾率增大粘度降低*2影響熒光強度的因素2）溫度對熒光強度的影響隨著溫度的增3）介質(zhì)酸度的影響

*2影響熒光強度的因素具酸或堿性基團(tuán)的有機物質(zhì)，在不同pH值時，熒光體的存在型體不同，不同的型體(分子與其離子)在電子構(gòu)型上有所不同，而且基態(tài)和激發(fā)態(tài)所表現(xiàn)出來的酸、堿性也有所差別

苯胺：弱的有機堿在堿性溶液pH7～12中以分子形式存在，藍(lán)色強熒光在酸性pH<2或>13以離子形式存在，熒光弱。3）介質(zhì)酸度的影響*2影響熒光強度的因素具酸或堿性基團(tuán)的3溶液熒光的猝滅*熒光物質(zhì)分子其它物質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象1）碰撞猝滅：熒光分子與淬滅劑分子碰撞2）靜態(tài)猝滅：熒光分子與淬滅劑分子生成非熒光配合物3）轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅：引入溴、碘、溶解氧4）發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅：甲基藍(lán)與Fe2+5）熒光物質(zhì)自猝滅3溶液熒光的猝滅*熒光物質(zhì)分子其它物質(zhì)分子相互作用引起熒光*3.2熒光光譜儀吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)3.2.1熒光光譜儀基本結(jié)構(gòu)單色器與紫外-可見光譜儀的不同*3.2熒光光譜儀吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)3.2*光源1.光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型：氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源：發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強度大*光源1.光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜2.氙燈*單色器第一單色器：在光源與樣品池之間，濾去不需要的光，得到所需要的激發(fā)光。第二單色器：在樣品池與檢測器之間，濾去溶劑、容器表面散射光，瑞利和拉曼光以及雜質(zhì)發(fā)出的散射光等，獲得待測物質(zhì)發(fā)射的熒光。

光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？*單色器第一單色器：在光源與樣品池之間，濾去不需要的光，得到*檢測器光電倍增管放大倍數(shù)：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光熒光分光光度計的樣品池四面透光波長范圍3.使用注意事項容易破碎問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題*檢測器光電倍增管樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫*3.3分子熒光分析法的應(yīng)用3.3.1熒光分析法分類一、直接熒光法問題：基體干擾較為嚴(yán)重芳香族有機化合物分析二、間接熒光法（衍生化法和熒光探針法）衍生化法或熒光探針法待測物與衍生化試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)3.3.2熒光定性分析與標(biāo)準(zhǔn)品的激發(fā)和發(fā)射光譜譜圖進(jìn)行對照三、熒光分析法特點1)靈敏度高（1-100ppb)：有的可達(dá)0.01ppb；2)選擇性強；3)方法簡單快速，用樣量少;4)提供比較多的物理參數(shù)。*3.3分子熒光分析法的應(yīng)用3.3.1熒光分析法分類一、3.3.3熒光定量分析*定量依據(jù)1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法（校準(zhǔn)曲線法）2.單點校正法（標(biāo)準(zhǔn)對比法）c1c2c3c4c5cxcscxAsAxcs和cx應(yīng)很接近3.3.3熒光定量分析*定量依據(jù)1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法（校準(zhǔn)曲線*3.3.4熒光分析法的應(yīng)用1無機化合物的熒光分析衍生化法：與熒光試劑形成熒光配合物*3.3.4熒光分析法的應(yīng)用1無機化合物的熒光分析衍生化*3.3.4熒光分析法的應(yīng)用2有機化合物的熒光分析3生物大分子的熒光分析直接法：可測定的化合物很少衍生化法：與熒光試劑形成共價化合物待測物試劑λexmaxλemmax測定范圍ppm丙三醇苯胺紫外藍(lán)色0.1~2糠醛蒽酮