蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)方案

生化試驗(yàn)指導(dǎo)試驗(yàn)一：蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反響目的：了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的根本構(gòu)造單位及主要連接方式。了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反響原理。學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。〔一〕試驗(yàn)原理

白質(zhì)的定性或定量測(cè)定。試驗(yàn)器材及試劑器材：試劑：試驗(yàn)步驟

試管、酒精燈、試管夾、試管架尿素〔2〕10%氫氧化鈉溶液〔3〕1%硫酸銅溶液〔4〕2％卵清蛋白溶液取少量尿素結(jié)晶，放在枯燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開頭硬化時(shí)，停頓加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10％氫氧化鈉溶1毫升，振蕩混勻，再加11滴，再振蕩。觀看消滅的粉紅顏色。避開添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。l102毫升，搖勻，12滴，隨加隨搖，觀看紫玫色的消滅。試驗(yàn)原理α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反響生成藍(lán)紫色物質(zhì)。1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反響，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。CO2、NH3和同另一個(gè)水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質(zhì)。器材：試劑：

試管、酒精燈、試管夾、試管架(1)蛋白質(zhì)溶液：2％卵清蛋白或穎雞蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)(2)0.5％甘氨酸溶液0.1％茚三酮水溶液(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液試驗(yàn)步驟10.5毫升1—2分鐘，觀看顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。在一小塊濾紙上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴上一0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色，觀看紫紅色斑點(diǎn)的消滅。〔三〕黃色反響試驗(yàn)原理式如下：試驗(yàn)器材及試劑器材：試管、酒精燈、試管夾、試管架試劑：雞蛋清溶液將穎雞蛋的蛋清與水按1：20混勻，然后用六層紗布過濾。大豆提取液 將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀用紗布過濾。(3)頭發(fā) (4)指甲 (5)0.5％苯酚溶液(6)濃硝酸(7)0.3％色氨酸溶液(8)0.3％酪氨酸溶液 (9)10％氫氧化鈉溶液試驗(yàn)步驟慢可略放置或用微火加熱。待各管消滅黃色后，于室溫下逐滴參加10％氫氧化鈉溶液至堿性，觀看顏色變化?！菜摹晨捡R斯亮藍(lán)反響試驗(yàn)原理作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。A595nm值成正比。常用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。器材：試劑：考馬斯亮藍(lán)染液蛋白質(zhì)樣品思考題原理？從本次試驗(yàn)的每個(gè)試驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)留意的事項(xiàng)都有哪些？試驗(yàn)二蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反響一、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定試驗(yàn)?zāi)康牧私獾鞍踪|(zhì)的兩性解離性質(zhì)。學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法。試驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在以下平衡pH到達(dá)肯定質(zhì)的變化測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測(cè)其溶解度最低時(shí)的溶液pH值。酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)pH值的緩沖液。向諸緩沖溶pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。器材：200100乳缽試劑：試驗(yàn)步驟

(2)1.00摩爾／升醋酸溶液0.10摩爾／升醋酸溶液0.01摩爾／升醋酸溶液4支，按下表顛序分別準(zhǔn)確地參加各試劑，然后混勻。11、2345.9。觀看其混濁度。靜置分鐘后，pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。二、蛋白質(zhì)的沉淀及變性試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)原理

加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的生疏。了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其有用意義。(3)了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系體顆粒，在肯定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)穎拉可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反響可分為兩類。(1)可逆的沉淀反響；試驗(yàn)器材及試劑試劑：試驗(yàn)步驟

蛋白質(zhì)溶液pH4.7醋酸—醋酸鈉的緩沖溶液(3)3%硝酸銀溶液(4)5％三氯乙酸溶液(5)95％乙醇(6)飽和硫酸銨溶液7)硫酸銨結(jié)晶粉末(8)0.1mol/L鹽酸溶液0.1mol/L氫氧化鈉溶液(10)0.05碳酸鈉溶液(11)0.1mol/L醋酸溶液(12)甲基紅溶液蛋白質(zhì)的鹽析。無機(jī)鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等)濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。銨溶液中才能析出。55毫升于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜么？重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取一支試管，參加蛋白質(zhì)溶液2毫升，再加31～2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾出上消液，向沉淀中參加少量的水，沉淀是否溶解？為什么？某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)215％三氯乙酸溶液，振蕩淀是否溶解。有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)295％乙醇。混勻，觀看沉淀的生成。思考題通過本試驗(yàn)?zāi)惆盐樟藥追N鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法?它們的原理?有什么意義？pI是固定常數(shù)的嗎？質(zhì)等電點(diǎn)沉淀。依據(jù)試驗(yàn)現(xiàn)象，爭論以下問題：蛋白質(zhì)可逆沉淀與不行逆沉淀的本質(zhì)區(qū)分是什么？簡述蛋白質(zhì)的沉淀反響、變性作用和凝固作用的相互關(guān)系。試驗(yàn)四氨基酸的分別鑒定―紙層析法試驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過氨基酸的分別，學(xué)習(xí)紙層析法的根本原理及操作方法把握氨基酸紙上層層析法的操作技術(shù)〔點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、試驗(yàn)原理層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。Rf值(比移)來表示的：Rf=/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的試驗(yàn)利用紙層析法分別氨基酸。器材：層析缸、毛細(xì)管、噴霧器、培育皿、層析濾紙?jiān)噭?0mL正丁醇15mL5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培育皿中備用。氨基酸溶液0.5％的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液(0．5％)。試驗(yàn)步驟將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。取層析濾紙(22cm14cm)2～3cm處用鉛2cm作一記號(hào)。6個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每3mm。20mL擴(kuò)展劑的培育皿，快速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培育皿中(點(diǎn)樣的一端在下，1cm)15―20cm時(shí)即取出濾紙，鉛筆描出溶劑前沿界限，自然枯燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。顯色用噴霧器均勻噴上0。15分鐘(100℃)或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。Rf值。思考題何謂紙層析法?f值?f值的主要因素是什么?3.怎樣制備擴(kuò)展劑?試驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。試驗(yàn)原理35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳質(zhì)后便可得到純酪蛋白。器材：試劑：1.穎牛奶2.95%乙醇無水乙醚4.0.2mol/LpH4.7醋酸——醋酸鈉緩沖液5.乙醇——乙醚混合液：乙醇∶乙醚=1∶1〔V/V〕試驗(yàn)步驟一〕酪蛋白的粗提40℃、pH4.7的醋酸緩沖液pHpH4.7。5分鐘0rn制品?！捕忱业鞍椎募兓?0分鐘3n，棄去上清液。用乙醇—22次，抽干。將沉淀攤開在外表上，風(fēng)干；得酪蛋白純品準(zhǔn)確稱重，計(jì)算含量和得率。mL牛乳〔g%〕牛乳。測(cè)得含量/x100%牛乳。思考題1.制備高產(chǎn)率純酪蛋白的關(guān)鍵是什么？2試設(shè)計(jì)另一種提取酪蛋白的方法試驗(yàn)?zāi)康募由顚?duì)酶的性質(zhì)的生疏?！惨弧硿囟葘?duì)酶活力的影響試驗(yàn)原理37～4050～60℃。100℃，I100℃的溶液中卻很快地完全失去活性。試驗(yàn)器材及試劑器材：試劑：0.3％氮化鈉溶液。需穎配制。50倍，(稀釋倍數(shù)可依據(jù)各人唾液淀粉酶活性調(diào)整)混勻備用。2010100毫升水中。使用前稀釋10倍。淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來推斷。試驗(yàn)步驟下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來推斷。3支試管，編號(hào)后按下表參加試劑：1號(hào)、337℃恒溫水浴中，2號(hào)試管放人冰水中。10)用碘化鉀—1、2、3管內(nèi)10分鐘后，再用碘液試驗(yàn)，結(jié)果如何？〔二〕pH對(duì)酶活力的影響試驗(yàn)原理原理pHpH值不同。本試驗(yàn)觀看pH6.8。器材：試管及試管架、吸管、滴管、50毫升錐形瓶、恒溫水浴。試劑：0.30.5％淀粉溶液50倍的穎唾液(3)0.2摩爾／升磷酸氫二鈉溶液(4)0.1摩爾檸檬酸溶液(5)碘化鉀—碘溶液(6)pH試紙：pH＝5、pH＝5．8、pH＝6．8、PH＝8四種試驗(yàn)步驟0.2摩爾／升磷酸15080的四種緩沖液。2502毫升。向1I3管取出一滴混合液，置于白1小滴碘化鉀—1—2滴碘化鉀—碘溶液。添加碘化鉀—碘溶1分鐘。pH對(duì)唾液淀粉酶活性的影響。?〔三〕唾液淀粉酶的活化和抑制試驗(yàn)原理為其抑制劑。器材：(1)恒溫水浴試劑：(10.1％淀扮溶液50倍的穎唾液(5)1%硫酸鈉溶液碘化鉀—碘溶液試驗(yàn)步驟?????????試驗(yàn)原理

〔四〕酶的專一性例，來說明酶的專一性。Benedict試劑檢查糖的復(fù)原性。試驗(yàn)器材及試劑器材：恒溫水浴、沸水浴、試管及試管架試劑：(1)2％蔗糖溶液1％淀粉溶液(需穎配制)50倍的穎唾液(4)蔗糖酶溶液(5)Benedict氏試劑?試驗(yàn)步驟思考題1.什么是酶的最適溫度及其應(yīng)用意義？pH？對(duì)酶活性有什么影響？3.什么是酶的活化劑？4.什么是酶的抑制劑？與變性劑有何區(qū)分？—米氏常數(shù)的測(cè)定試驗(yàn)?zāi)康牧私獾孜餄舛葘?duì)酶促反響的影響。試驗(yàn)原理v──反響初速度〔微摩爾濃度變化n；V──最大反響速度〔微摩爾濃度變化n；S］──底物濃度L──米氏常數(shù)〔L。試驗(yàn)原理Km值等于酶促反響速度到達(dá)最大反響速度一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的底物濃度。不同的酶Km值也不同，KmKm值大，說明親和力小；KmKm值是酶學(xué)爭論的一個(gè)重要方法。大多數(shù)純酶的KmKm值的最常用的簡便方法：本試驗(yàn)以胰蛋白酶消化Km值。的數(shù)量而跟蹤反響，求得初速度。器材：5mL，10mL100mL、25mL堿式滴定管及滴定臺(tái)、蝴蝶夾、恒溫水浴、滴管試劑：0～L〔5%乙醇溶液、NaOH溶液、胰蛋白酶溶液試驗(yàn)步驟5mL10.1MNaOH滴定至微紅色，4個(gè)瓶顏色應(yīng)當(dāng)全都，編號(hào)。150mL三角瓶，3710分鐘，同時(shí)105mL〔同時(shí)〕L反響液〔0時(shí)樣品〕參加一含甲醛的小100.1MNaOH滴定至微弱而持續(xù)的微紅色。在NaOHmLmL加一滴酚酞，再連續(xù)滴至終點(diǎn)，登記NaOHmL數(shù)。10mL2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)小三NaOHmL數(shù)。NaOHmL數(shù)〕對(duì)時(shí)間作圖，得始終線，其斜率即初速度為40g/L的酪蛋白濃度。4.30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重復(fù)上述操作，分別測(cè)出V30、V20、V10。3．在〔1〕試驗(yàn)說明，反響速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著反響時(shí)間的延長，酶促反響速度漸漸下降。緣由有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加pH及溫度下局部失活等。因此，爭論酶的活力以酶促反響的初速度為準(zhǔn)?！?〕本試驗(yàn)是一個(gè)定量測(cè)定方法，為獲得準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)盡量削減試驗(yàn)操度的準(zhǔn)確性。各種試劑的加量也應(yīng)準(zhǔn)確，并嚴(yán)格掌握準(zhǔn)確的酶促反響時(shí)間。思考題試述底物濃度對(duì)酶促反響速度的影響。Km值可以作為鑒定酶的一種手段，為什么？Km值有何實(shí)際應(yīng)用？試驗(yàn)十三小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較試驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理和使用方法。學(xué)習(xí)測(cè)定淀粉酶活力的方法。試驗(yàn)原理芽天數(shù)的增長而增加。器材：20mL具塞刻度試管、試管架、刻度吸管、分光光度計(jì)試劑：小麥種子、標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液LH9l／L1％淀粉溶液、1％3，5-二硝基水楊酸試劑、1％氯化鈉溶液、海砂試驗(yàn)步驟種子發(fā)芽小麥種子浸泡2.525℃恒溫箱內(nèi)或在室溫下發(fā)芽。酶液提取取發(fā)芽第3415200mg110mL，用力磨碎。在室溫下放置20分鐘，攪拌幾次。然后將提取液離心〔1500r／min〕6～7分鐘。將上清液倒入量筒，測(cè)定酶提取10倍。2.515粒作為比照〔提取步驟同上。酶活力測(cè)定4