納米藥物載體入胞及轉(zhuǎn)運(yùn)課件

納米藥物載體入胞及轉(zhuǎn)運(yùn)——載體設(shè)計(jì)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)SeminarII學(xué)生：張德蒙導(dǎo)師：馬小軍研究員劉袖洞教授2012.12.13納米藥物載體入胞及轉(zhuǎn)運(yùn)SeminarII學(xué)生：張德蒙導(dǎo)師：1主要內(nèi)容四展望一背景介紹二納米藥物入胞三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)主要內(nèi)容四展望一背景介紹二納米藥物入胞三納米藥物胞2一背景介紹1納米藥物尺寸：1-1000nm納米藥物納米囊膠束無(wú)機(jī)納米聚合物脂質(zhì)體組成：載體+藥物穩(wěn)定性差彌補(bǔ)裸藥缺陷靶向傳遞穿透生理屏障基因藥物口服蛋白藥物環(huán)孢菌素A紫杉醇難溶難滲藥物緩、控釋靜脈給藥一背景介紹1納米藥物尺寸：1-1000nm納米納米囊膠束32納米藥物傳遞系統(tǒng)納米藥物傳遞系統(tǒng)：控制藥物釋放時(shí)間及位點(diǎn)靶向傳遞一背景介紹時(shí)間：載體穩(wěn)定性及與載體與藥物結(jié)合緊密程度位點(diǎn)：載體胞外及胞內(nèi)傳遞過(guò)程組織器官細(xì)胞亞細(xì)胞分子緩控釋增強(qiáng)藥效降低毒副作用入胞及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)穿透生理屏障靶向傳遞的不同層次彌補(bǔ)裸藥缺陷胞內(nèi)釋放2納米藥物傳遞系統(tǒng)納米藥物傳遞系統(tǒng)：控制藥物釋放時(shí)間及位點(diǎn)4一背景介紹胞外傳遞RES、血管、胞外基質(zhì)細(xì)胞傳遞A.T.Florence,JournalofControlledRelease,2012,164,115–1242納米藥物傳遞系統(tǒng)聚集、擴(kuò)散、流體力學(xué)特性細(xì)胞膜：內(nèi)吞胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放細(xì)胞內(nèi)吞、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究不斷完善，進(jìn)步與爭(zhēng)議并存納米藥物內(nèi)吞、轉(zhuǎn)運(yùn)研究滯后一背景介紹胞外傳遞RES、血管、胞外基質(zhì)細(xì)胞傳遞A.T.5二納米藥物入胞1內(nèi)吞機(jī)制RuthDuncan,Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402清除細(xì)胞碎片、免疫監(jiān)視細(xì)胞間/胞內(nèi)細(xì)胞通訊、神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密度重塑細(xì)胞外環(huán)境細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)masterorganizer吞噬Celleating胞飲Celldrinking二納米藥物入胞1內(nèi)吞機(jī)制RuthDuncan,Mol6納米材料聚集體調(diào)理素作用后的納米粒1內(nèi)吞機(jī)制(1)吞噬吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)：血液清除纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(200nm-μm)細(xì)胞種類作用對(duì)象影響因素細(xì)胞種類納米材料性質(zhì)Carreno-GomezB.,DuncanR.,Int.J.Pharm.1997,148,231?240RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Militello,R.D.etal.Int.J.Pharm.1997,148,231?240B16-F10吞噬殼聚糖微球納米材料聚集體1內(nèi)吞機(jī)制(1)吞噬吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、單77.5μm納米材料性質(zhì)對(duì)胞吞的影響尺寸與形狀表面性質(zhì)200nm~μm，非關(guān)鍵與接觸狀態(tài)有關(guān)，研究較少1內(nèi)吞機(jī)制(1)吞噬與調(diào)理素作用：親疏水性、表面電荷與細(xì)胞作用：表面電荷、親疏水性J.A.Champion,S.Mitragotri,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2006,103,4930–4934MilitelloR.D.,ColomboM.I.,Curr.Mol.Med.2011,11,197?203肺泡巨噬細(xì)胞與聚苯乙烯微球電荷密度調(diào)理素作用疏水性負(fù)電荷>正電荷表面帶電材料胞吞效率高于中性；疏水>親水7.5μm納米材料性質(zhì)對(duì)胞吞的影響尺寸與形狀表面性質(zhì)200n8網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞(CME)表面受體：LDLR、EGFR、TfR、Lectins配體修飾的納米粒及病毒顆粒非特異性的電荷、親疏水性作用引發(fā)胞吞效率較受體依賴型低1內(nèi)吞機(jī)制(2)胞飲最基本胞吞方式研究最為透徹動(dòng)力蛋白依賴150nm100nm受體介導(dǎo)的CME非受體介導(dǎo)的CME：液相胞吞RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Herve’Hillaireau,PatrickCouvreur.Cell.Mol.LifeSci.2009,66,2873–2896網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞(CME)表面受體：LDLR、EGFR、Tf9小窩蛋白排列瓶狀膜結(jié)構(gòu)，50-80nm膜區(qū)富含膽固醇和鞘磷脂上皮細(xì)胞含量最為豐富(10-20%)，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞含量同樣豐富。CvME胞吞速度比CME慢得多配體介導(dǎo)：葉酸、白蛋白、膽固醇巨胞飲肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)伸展的膜直接落回膜表面,1μm~5μm未發(fā)現(xiàn)配體-受體選擇性參與納米藥物內(nèi)化小窩介導(dǎo)內(nèi)吞(CvME)1內(nèi)吞機(jī)制(2)胞飲RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Herve’Hillaireau,PatrickCouvreur.Cell.Mol.LifeSci.2009,66,2873–2896小窩蛋白排列瓶狀膜結(jié)構(gòu)，50-80nm巨胞飲肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)小窩10納米藥物傳遞的影響研究仍處于很初級(jí)的階段其他內(nèi)吞方式1內(nèi)吞機(jī)制(2)胞飲非網(wǎng)格蛋白/小窩蛋白依賴內(nèi)吞方式脂筏結(jié)構(gòu)蛋白依賴的內(nèi)吞與小窩介導(dǎo)內(nèi)吞機(jī)理類似，40-50nmClathrin-independentcarrier/GPI-AP-enrichedearlyendosomalcompartmentInterleukin2receptorbpathway,orRhoA-dependentuptakeRuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402Tore-GeirIversen,etal.NanoToday,2011,6,176—185納米藥物傳遞的影響研究仍處于很初級(jí)的階段其他內(nèi)吞方式1內(nèi)吞11肌動(dòng)蛋白、微管蛋白二納米藥物入胞2內(nèi)吞機(jī)制定量M.Koivusalo,C.Welch,etal.J.CellBiol.2010,188,547—563L.Pelkmans,D.Puntener,etal.Science,2002,296,535—539H.Y.Nametal.JournalofControlledRelease135(2009)259–267判斷納米藥物入胞的途徑：胞吞抑制劑內(nèi)吞機(jī)制非獨(dú)立內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的分子包被蛋白、銜接子、分離蛋白，RabGTP酶（60多種）內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)依賴的細(xì)胞骨架抑制劑非專一性繼續(xù)努力藥物受抑制內(nèi)吞通路簡(jiǎn)單原理阿米洛利(Amiloride,或EIPA/HOE-694)巨胞飲降低膜表面pH阻斷Rac1/Cdc42信號(hào)傳遞細(xì)胞松弛素D(CytochalasinD)actin聚合抑制劑氯丙嗪(Chlorpromazine)CMERhoGTPase抑制劑DynasoreCME、吞噬作用、小窩胞吞等動(dòng)力蛋白依賴機(jī)制動(dòng)力蛋白抑制劑菲律賓素(Filipin)、Nystatin、LovostatinCvME、脂筏胞吞等于膽固醇相關(guān)入胞機(jī)制與膽固醇作用或干擾其代謝染料木素(Genistein)CvME酪氨酸激酶抑制劑，阻斷小窩形成Cy5.5-疏水性修飾乙二醇?xì)ぞ厶羌{米粒(HGC)CMECvMEMPT肌動(dòng)蛋白、微管蛋白二納米藥物入胞2內(nèi)吞機(jī)制定量M.Ko12二納米藥物入胞細(xì)胞方面極性細(xì)胞：基底端與頂端胞吞機(jī)制不同細(xì)胞種類：影響最大細(xì)胞狀態(tài)：密度、細(xì)胞周期、代謝及胞外基質(zhì)的變化3內(nèi)吞過(guò)程影響因素內(nèi)吞相關(guān)物質(zhì)種類繁多，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路復(fù)雜ZaunerW,FarrowNA,HainesAMR,JControlRelease,2001,71,39-51不同細(xì)胞、不同狀態(tài)對(duì)不同粒徑納米粒胞吞結(jié)果二納米藥物入胞細(xì)胞方面極性細(xì)胞：基底端與頂端胞吞機(jī)制不同細(xì)13形狀：研究處于初級(jí)階段，影響因素較多且難以區(qū)分尺寸與形狀聚苯乙烯顆粒胞飲200nm吞噬、巨胞飲StephanieE.A.Gratton,etal.,BioconjugateChem.,2010,21,797-8023內(nèi)吞過(guò)程影響因素納米載體方面形狀：研究處于初級(jí)階段，影響因素較多且難以區(qū)分尺寸與形狀聚苯14載體表面性質(zhì)與負(fù)電性細(xì)胞膜作用，荷正電粒子更易與細(xì)胞膜吸附并完成內(nèi)吞電位10~25mV，但并不絕對(duì)。Harush-FrenkelO,DebottonN,BiochemBiophysResCommun,2007,353,26-32ZhangLW,Monteiro-RiviereNA,ToxicologicalSciences,2009,110,138-155HeLaPEG-PLAE.Garcia-Garciaetal.,CMLS,Cell.Mol.LifeSci.2005,62,1400-1408表面修飾PEG，增強(qiáng)胞吞(受體作用，提高血液循環(huán)時(shí)間)3內(nèi)吞過(guò)程影響因素表面電荷親疏水性：靶向配基HeeDongHan,etal.,ClinCancerRes,2010,16,3910-3922小分子(葉酸)、蛋白(Tr)、CPP(RGD)靶向配體密度不可控、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性受體內(nèi)化率低、受體表達(dá)下調(diào)臨床效果有限QD655QD655-NH2QD655-COOH2nM20nM人腎胚胎(HEK)細(xì)胞載體表面性質(zhì)與負(fù)電性細(xì)胞膜作用，荷正電粒子更易與細(xì)胞膜吸附并153內(nèi)吞過(guò)程影響因素納米藥物主動(dòng)靶向I.K.Kwonetal.JournalofControlledRelease,2012,164,108–114D.B.Kirpotin,etal,CancerRes,2006,66,6732–6740小鼠腫瘤中脂質(zhì)體變化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)anti-HER2Cetuximab、trastuzumab、EC0489、EC0145

療效改善源于EPR效應(yīng)的被動(dòng)靶向或局部給藥體外:藥物-細(xì)胞無(wú)障礙藥物高濃度細(xì)胞受體表達(dá)穩(wěn)定體內(nèi)：？RES系統(tǒng)靶向：17%達(dá)到肝臟其他部位靶向：藥物累積<0.01%HPMAcopolymer?doxorubicin?galactose唾液酸糖蛋白受體3內(nèi)吞過(guò)程影響因素納米藥物主動(dòng)靶向I.K.Kwonet16M.deSmet,etal.J.Control.Release,2011,150102–110I.K.Kwonetal.JournalofControlledRelease,2012,164,108–114RES(脾、肝、肺)捕獲無(wú)動(dòng)力，自由擴(kuò)散血液中藥物釋放主動(dòng)靶向？平面細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞受體表達(dá)差異？時(shí)間&密度受體飽和與循環(huán)時(shí)間差異？細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞外環(huán)境變化？3內(nèi)吞過(guò)程影響因素納米藥物主動(dòng)靶向血液循環(huán)PEG修飾：長(zhǎng)循環(huán)？24h僅剩10%靶向修飾脂質(zhì)體血液藥物釋放細(xì)胞層緊密程度對(duì)藥物擴(kuò)散的影響M.deSmet,etal.J.Control.17三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程由入胞方?jīng)Q定，胞吞物或經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程重新排出胞外，或進(jìn)入溶酶體消化降解1納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)路徑Tore-GeirIversen,etal.NanoToday,2011,6,176—185P.Gonnordetal.SeminarsinCell&DevelopmentalBiology,2012,23,154-164三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程由入胞方?jīng)Q定，胞吞物或經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程18早期內(nèi)體(EE)約5min到達(dá)，pH6.5胞吞物與受體分離材料分選：循環(huán)或者代謝通路內(nèi)含蛋白與循環(huán)受體Rab5EarlyEndosomalAntigen1(EEA1)Transferrinreceptor(TfR)循環(huán)內(nèi)體(RE)約30min到達(dá)，30-60min內(nèi)循環(huán)至細(xì)胞質(zhì)膜包含循環(huán)材料的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)Rab11Transferrinreceptor(TfR)晚期內(nèi)體(LE)60min后到達(dá)，pH6.0甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)介導(dǎo)高爾基體分泌的溶酶體小泡不斷融合含有高度糖基化的溶酶體膜相關(guān)蛋白(LAMPs)含有內(nèi)在膜，多泡體M6PRRab7LAMPs1-3Rab7溶酶體(LYS)pH4.5-5.5與胞吞物降解及細(xì)胞自噬密切相關(guān)，包含60多種溶酶體酶LAMPs組織蛋白酶D(cathepsinD)細(xì)胞器特征Marker2參與轉(zhuǎn)運(yùn)的主要細(xì)胞器三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)RuthDuncan,etal.Mol.Pharmaceutics2012,9,2380?2402早期內(nèi)體(EE)約5min到達(dá)，pH6.5Rab5Early19P.Gonnordetal.,SeminarsinCell&DevelopmentalBiology,2012,23,154-164三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)3轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程監(jiān)測(cè)方法Q.O.Garred,etal.Traf?c2,2001,2,26-36SternST,etal,Tox.Sci.2008,106,140–152透射電鏡細(xì)胞器Marker熒光標(biāo)記形態(tài)學(xué)判斷細(xì)胞器位置及形態(tài)細(xì)胞間差異較大樣品處理對(duì)形態(tài)的影響分辨率限制：高分辨熒光成像技術(shù)內(nèi)化標(biāo)記物動(dòng)態(tài)移動(dòng)細(xì)胞器Marker非專一性目標(biāo)熒光與細(xì)胞器熒光融合專一高效Marker驗(yàn)證Au溶菌酶QD豬腎細(xì)胞P.Gonnordetal.,Seminars20三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)4轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的調(diào)控了解納米藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，尋求實(shí)現(xiàn)最佳藥效的的轉(zhuǎn)運(yùn)方式內(nèi)吞決定轉(zhuǎn)運(yùn)的例外病原體(分支桿菌、沙門(mén)氏菌等)擾亂轉(zhuǎn)運(yùn)避免進(jìn)入LYS降解降低免疫識(shí)別的可能性內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)復(fù)合物泛素化海參毒素、蓖麻毒素多途徑內(nèi)吞，轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程相同泛素化標(biāo)記：降解通路去泛素化標(biāo)記：循環(huán)通路極性細(xì)胞入胞方式相同，轉(zhuǎn)運(yùn)路徑不同闡明轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程變化機(jī)制，有助于納米藥物胞內(nèi)定向傳遞Sandvig,K.,etal.,FEBSLett.,

2010,584,2626?2634三納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)4轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的調(diào)控了解納米藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，21分子量>1000Da需通過(guò)內(nèi)吞細(xì)胞穿透肽4轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的調(diào)控納米藥物胞內(nèi)定向傳遞pH響應(yīng)載體、溶酶體酶降解載體親溶酶體傳遞：細(xì)胞質(zhì)傳遞：親內(nèi)體傳遞：轉(zhuǎn)胞吞作用pH6.5響應(yīng)溶酶體融合前釋放或阻斷轉(zhuǎn)運(yùn)極性細(xì)胞單向轉(zhuǎn)運(yùn)——