病毒的分離鑒定

病毒的分別與鑒定要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，則必需滿足以下原則：①從患病者體內分別出病毒；②在試驗動物或寄主細胞中可以培育；③證明這種培育物具有濾過性；④在原始宿主或相關種屬內能產生同樣的病癥；⑤能重分別出病毒。病毒的分別標本的處理標本的收集5g50mlPBS20-25顆玻璃小100ml無菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清，3000Xg,4C心6min。拭子和生物體液：拭子浸在2-3ml運載培育基中，將棉拭子中的3000Xg4C30min。組織標本：用無菌乳缽或勻漿器研磨組織標本，同時參加足量的PBS20%的懸液，3000Xg4C30min。除菌處理a〕10000單位/4Cb〕鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為2023單位/4C4小時。精選文庫精選文庫C〕對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等，則可參加等量的乙醚4C病毒的分別培育病毒是嚴格的細胞內寄生微生物，培育病毒必需使用細胞。依據病毒的不同選用敏感動物〔動物接種〕、雞胚〔雞胚接種〕或離體細胞進展分別培育〔細胞培育〕。雞胚接種 雞卵的選擇：一般都選穎、10天以內的受精卵以保證規(guī)格質量上的全都。孵育：孵育時可將雞卵放入卵箱內進展，氣室向上，孵育的最適溫38--39C40—708日后，雞卵應每天1—2次，以幫助雞胚發(fā)育均勻和防止雞胚膜粘連。C 4?5天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育狀況〔二〕天一次〕。①未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影。②活雞4天后，在檢卵器上就可見到清楚的血管，雞卵內有一小黑點〔雞胚〕，有明顯的自然轉動。③死胎：假設覺察雞卵血管模糊、擴張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉動，則可推斷胚胎頻死或已經死亡，應將其挑撿出來 雞胚孵育完畢后，用鉛筆劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。

1.雞胚卵黃囊接種：用5?8天雞胚，以瘦長12?囊膜檢查胚,常用于某些羊膜腔病毒育分取羊水檢查。常用干流感病毒的初次分別。精選文庫精選文庫3圖3.圖3.尿囊腔接種9?12天雞弗賈0胚，將標本接種于尿囊腔，腮腺炎病毒等。4.10?l2天amme)剖檢及收獲14C過夜，使雞胚內血液凝固。收獲時，用碘酒將氣室部卵殼消毒,將氣室處卵殼剝去〔不要將碎片落入殼膜〕。然后用無菌手術刀柄從胚胎背部輕輕下壓，〔切勿壓破卵黃囊〕再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶內，于低溫保存。f〕優(yōu)缺點優(yōu)點：技術簡潔、來源充分、價格低廉、數量可大、不需特別設備。缺點：很多病毒不能適應，主要是哺乳動物的病毒。122細胞培育細胞培育〔cellculture〕是指利用機械、酶或化學方法使動物組織或2?4個細胞團懸液進展培育。依據細胞的精選文庫精選文庫4類型和培育細胞代數的不同，可將其分為兩種：原代細胞培育；傳代細胞培育。組織細胞培育的病毒，當消滅穩(wěn)定的細胞病變后，就可取培育液或培育液與細胞培育物混和物，細胞培育物中的病毒可承受凍融、超聲波等方法使其釋放出來。優(yōu)點:每個細胞生理特性根本全都，對病毒易感性相等;無個體差異，準確性和重復性好;C)可嚴格執(zhí)行無菌操作;細胞培育本身就能顯示病毒的生長特征;應用空斑技術可進展病毒的克隆化。病毒的鑒定形態(tài)學鑒定細胞病變效應(cytopathiceffect，CPE)：病毒在細胞內增殖后,可引起細胞的不同變化。常見的形態(tài)學轉變如細胞圓縮、聚合、溶解或脫落。CPE消滅的時間是鑒定病毒的標志之一。某些病毒感染細胞產生的特征性的形態(tài)變化，在一般光學顯微鏡F可見胞漿或胞核內消滅的呈嗜酸性或嗜堿性染色、形或不規(guī)章形的團塊狀構造，病毒學上稱為包涵體。血吸附和血凝作用

大小數量不等的圓多見于以出芽方式釋放的病毒。血吸附指感染細胞具有吸附紅細胞的力量；血凝作用指感染細胞的培育液中有很多游離病毒存在，具有凝集紅細胞的作用。221血吸附試驗具有血凝力量的病毒能使感染的細胞吸附紅細胞， 這種現象被稱作吸附作用。大多數粘液病毒能引起吸附。具體檢驗步驟如下:PBS10%的豚鼠紅細胞懸液，4C0.5%的濃度〔10%1ml19mlPBS混勻〕。吸去比照和試驗管培育細胞的上清液，試驗管的上清液留待電鏡觀察。C 0.2ml紅細胞懸液，4C30min4CPBS清洗〕3次。顯微鏡下讀取結果并記錄，依據吸附紅細胞的量可分為0〔陰性〕~4〔完全吸附〕級。37C60min,有神經氨酸酶的病毒將會從紅細胞上游離下來。2.2.2血凝試驗1~1250al生理鹽水。150al50al2L,如此倍比1050al;最終兩孔〔11、12〕為紅細胞比照。C)1%1~1250al。d)手工震蕩，37C30min〔40min〕后觀看結果。電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、構造等必需借助電子顯微鏡進展檢查。對于目前尚難培育而形態(tài)又格外典型的病毒， 可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培育收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀看病毒粒子。7〔戊二醛/四氧化鋨〕77透、包埋與聚合77〔鈾染/鉛染〕a〕優(yōu)點：可觀看病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程。b〕缺點：操作簡單，費時，但標本可長時間保存。負染技術負染是指通過重金屬鹽在樣品四周的積存而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。具體步驟〔漂移法〕為：現將需負染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有支持膜的載網漂移在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網上僅有一薄層液膜，在樣品未干時即加一滴復染液的銅網上，用濾紙吸干多余的染液即可。a〕優(yōu)點：快速簡易〔10-20min〕;區(qū)分率高；圖象清楚地病毒構造。b〕107以上；全部樣品應處于懸浮狀態(tài)。血清學試驗ELISA、瓊脂集中、中和試驗、標記抗體技術等免疫血清學方法檢查病畜的抗體消長狀況和發(fā)病組織中的病毒抗原。241中和反響利用病毒與特異性中和抗體結合的特性鑒定病毒的種類， 觀看特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡，能否抑制病毒的細胞病變效應。2.4.2酶聯免疫吸附試驗 〔ELISA〕將