圓二色譜原理與應(yīng)用課件

圓二色譜CircularDichroism(CD)

原理與應(yīng)用圓二色譜CircularDichroism(CD)

1光的性質(zhì)：波粒二象性誕生人類對光的研究起源很早，但對光本質(zhì)的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了一個(gè)較漫長的過程。光究竟是波還是粒子？光的波動(dòng)說與微粒說之爭從十七世紀(jì)初開始，其間牛頓、惠更斯、托馬斯．楊、菲涅耳、愛因斯坦、波爾等多位著名的科學(xué)家努力揭開了遮蓋在“光的本質(zhì)”外面那層撲朔迷離的面紗，至二十世紀(jì)初以光的波粒二象性告終，前后共三百多年的時(shí)間。光的性質(zhì)：波粒二象性誕生人類對光的研究起源很2粒子性：光是某種粒子即光量子，具有粒子的性質(zhì)如反射，散射等現(xiàn)象。

波動(dòng)性：即光具有波動(dòng)性，有衍射、干涉等性質(zhì)墨子和他的學(xué)生做了世界上最早的“小孔成像”實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出了光沿直線傳播的科學(xué)解釋，并用此原理解釋了物體和投影的關(guān)系。愛因斯坦提出了光量子論，解釋了光電現(xiàn)象，揭示了微觀客體的波粒二重性粒子性：光是某種粒子即光量子，具有粒子的性質(zhì)波動(dòng)性：即光具有3光源發(fā)射光量子從演示中可以看出：光源發(fā)射的單個(gè)光量子的運(yùn)動(dòng)軌跡是一個(gè)軌跡為余弦函數(shù)的簡諧振動(dòng)軌跡方程為x＝Acos（ωt＋φ）

光源發(fā)射光量子從演示中可以看出：光源發(fā)射的單個(gè)光量子的運(yùn)動(dòng)軌4而真實(shí)光源向外發(fā)射的是連續(xù)的光量子如圖所示:圖中不同顏色的小球代表不同的光量子所有光量子在一個(gè)平面上我們稱之為平面偏振光它的軌跡方程為x＝Acos（ωt＋φ）公式中A為振幅與光強(qiáng)度的平方成正比

φ為初始相位

t為時(shí)間而真實(shí)光源向外發(fā)射的是連續(xù)的光量子如圖所示:圖中不同顏色的5我們平時(shí)看到的光為自然光具有:

1.方向隨機(jī)性自然光源向外發(fā)射方向性是隨機(jī)的光量子2.不連續(xù)性會(huì)產(chǎn)生無數(shù)初始相位不同的光量子糖葫蘆z

傳播方向360度旋轉(zhuǎn)的軌跡這兩個(gè)性質(zhì)決定自然光具有如圖所示的性質(zhì),既自然光可以看作圓柱形向前傳播的光我們平時(shí)看到的光為自然光具有:糖葫蘆z傳播方向360度6兩束光的合成:物理力學(xué)力的矢量合成:F1F3F2物體受到的兩個(gè)力F1,F2等同于物體受到這兩個(gè)力的矢量合成F3光的合成也遵循矢量合成:其合成為電場矢量的合成與光強(qiáng)度的平方成正比兩束光的合成:物理力學(xué)力的矢量合成:F1F3F2物體受到的兩7xytt1t0t1t2t3t4t0t2t3t4合成平面偏振光圖相互垂直的片面偏振光Φ2-Φ1=0取t0,t1,t2,t3,t4時(shí)間的截面xytt1t0t1t8Φ2-Φ1=pi/2AX=AYpi=3.141592圓偏振光x=AXcos(Wt+Φ1)y=AYcos(Wt+Φ2)xy如果AX=AY合成軌跡為圓如果AX=AY合成軌跡為橢圓垂直傳播方向Φ2-Φ1=pi/2AX=AYpi=3.1419下面我們研究以下兩束圓偏振光的合成:兩束旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振光如果振幅相同（振幅與光強(qiáng)度的平方成正比）矢量合成為平面偏振光。如果振幅不等則根據(jù)公式合成為下圖右圖所示的橢圓偏振光！下面我們研究以下兩束圓偏振光的合成:兩束旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振10圓二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶軸垂直晶軸電氣石晶體當(dāng)自然光入射到電氣石晶片的時(shí),晶片強(qiáng)烈地吸收振動(dòng)平面與晶軸垂直的光波,而只允許振動(dòng)平面平行與晶軸的光波通過,因此通過晶片的光就變?yōu)榫哂幸欢ㄆ矫娴钠窆?各向異性的物質(zhì)對不同方向的光吸收不同如圖所示：圓二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶軸垂直晶軸電氣石晶11平面不對稱的分子具有各向異性如氨基酸核酸、手性分子也對偏振光有調(diào)節(jié)活性平面不對稱的分子具有各向異性如氨基酸核酸、手性分子12當(dāng)兩束圓偏振光照射到含有這類分子的溶液時(shí):samplesolution溶液對左旋和右旋的圓偏振光的吸收不同這會(huì)導(dǎo)致EL不等于ER根據(jù)我們前面對振幅不同的兩束圓偏正光的疊加現(xiàn)象可以判斷透過樣品溶液的光變?yōu)橐皇鴻E圓偏振光當(dāng)兩束圓偏振光照射到含有這類分子的溶液時(shí):sampleso13當(dāng)溶液中的樣品的結(jié)構(gòu)不同,或成分不同我們可以得到不同的橢圓反過來我們可以通過檢測兩束旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振光透過樣品所產(chǎn)生的橢圓的不同來判斷樣品所含的成分,和結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)溶液中的樣品的結(jié)構(gòu)不同,或成分不同我們可以得到不同的橢圓14泰勒一階展開式inproperunits(CDspectroscopistsusedecimol)Perresidue2)為了方便比較我們用θ來描述橢圓的信息度圓二機(jī)器測量值光譜學(xué)家一般采用摩爾橢圓率和Deltaepslon大家形成統(tǒng)一的單位易于比較泰勒一階展開式inproperunits(CDspe15tan(i0)＝n2/n1時(shí)i0被稱為布魯斯特角此時(shí)的反射光為平面偏振光，利用該原理可制造起偏器。n1折射率n2折射率i0平面偏振光折射：雙折射：o-raye-ray當(dāng)一束光經(jīng)過各向異性的晶體或其他狀態(tài)的介質(zhì)時(shí)產(chǎn)生相互垂直的兩束偏振光o,e當(dāng)光離開晶體時(shí)的Φ2-Φ1=2*pi*l/(n0-ne)*入四分之一波片如果l=入/4/(n0-ne)則Φ2-Φ1=pi/2此時(shí)如果入射光與光軸夾角為45度時(shí)o,e的振幅相同則o,e合成的為圓偏振光.45deg45deg光軸光軸偏振光的產(chǎn)生:tan(i0)＝n2/n1時(shí)i0被稱為布魯斯特角此時(shí)的16圓二色譜儀器刨面圖M為鏡子,p為起偏器ls代表等和水晶圓二色譜儀器刨面圖M為鏡子,p為起偏器17CD特點(diǎn)測量的θ非常小CD測量的為2.32*(AL-AR)弧度以樣品有圓二信號一定要有紫外吸收但有紫外吸收不一定由遠(yuǎn)而信號CD特點(diǎn)測量的θ非常小18CD譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用CD譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用19Thepeptidebondisinherentlyasymmetric&isalwaysopticallyactive蛋白質(zhì)分子的固有不對稱性決定了蛋白質(zhì)的光學(xué)活性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的不同表現(xiàn)出其對圓二色性特征的差異所以我們可以通過圓二信號來測量蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息Thepeptidebondisinherently20圖為一些蛋白的(或肽)的標(biāo)準(zhǔn)園二譜圖圖為一些蛋白的(或肽)的標(biāo)準(zhǔn)園二譜圖21我們以肌紅蛋白為例193nm208nm223nm我們從圖中看到了193,208,,223特征峰與上一圖中全螺旋的蛋白的特征峰基本相同我們可以從這個(gè)信息斷定我們樣品的結(jié)構(gòu)主要為螺旋結(jié)構(gòu)我們以肌紅蛋白為例193nm208nm223nm我們從圖中22當(dāng)我們得到一個(gè)圖譜可以通過下表來和前面提到的標(biāo)準(zhǔn)圖譜來判斷我們樣品的結(jié)構(gòu)信息當(dāng)我們得到一個(gè)圖譜可以通過下表來和前面提到的標(biāo)準(zhǔn)圖譜來判斷我23對于螺旋性較高的蛋白可以通過下式初步估算螺旋的含量:但是準(zhǔn)確性較差不推薦對于螺旋性較高的蛋白可以通過下式初步估算螺旋的含量:24——

chymotrypsin(allb)——lysozyme(a+b)——triosephosphateisomerase(a/b)——myoglobin(alla)但一般蛋白的結(jié)構(gòu)信息是較復(fù)雜的并非標(biāo)準(zhǔn)的螺旋或折疊之類的結(jié)構(gòu)對于這些蛋白結(jié)構(gòu)的分析我們要選擇合適的軟件和算法進(jìn)行分析——chymotrypsin(allb)但一般蛋白的結(jié)25CD譜的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法:v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....180nm260nm△ξαHelix×a+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....△ξβsheet×b+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....△ξ×c=測量的樣品譜v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....△ξRandomcoila/(a+b+c)=螺旋含量b/(a+b+c)=折疊含量c/(a+b+c)=無規(guī)卷曲含量通過最最小二乘法求解出最優(yōu)a,b,c的值CD譜的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法:v11826RecommendedMethodsFordeterminationofglobularproteinconformationinsolution:SELCON,CDNNandK2D.Fordeterminationofpolypeptideconformation:LINCOMBwithasuitablepolypeptidesetofreferences.Fordeterminingtheeffectsofmutations,ligandsandperturbantsonproteinstructure:LINCOMB.Forevaluatingthenumberoffoldingstatesgivingrisetoasetofspectra:TheCCAalgorithmandSVD.RecommendedMethodsFordetermi27TheProteinCircularDichroismDataBank(PCDDB)http://pcddb.cryst.bbk.ac.uk/OnLineCircularDichroismAnalysishttp://public-1.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cca分析http://www2.chem.elte.hu/cgi-bin/ccaform061122-5lyxPGDxoLsM6-00園二二級結(jié)構(gòu)分析相關(guān)文獻(xiàn)/~sreeram/PDF/index.html下載軟件分析:/cdrwjweb/#InstructionsCdpro分析:定期更新:SELCON3,CDSSTR,andCONTINCLUSTER/~sreeram/CDPro/

TheProteinCircularDichroism28圓二色譜原理與應(yīng)用ppt課件29圓二色譜原理與應(yīng)用ppt課件30圓二色譜原理與應(yīng)用ppt課件31從CD譜分析準(zhǔn)確性對全、/和變性蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確度90-100%對+的準(zhǔn)確度為85%對全的準(zhǔn)確度為75%從CD譜分析準(zhǔn)確性對全、/和變性蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確度9032ApplicationsofCDinstructuralbiologyDeterminationofsecondarystructureofproteinsthatcannotbecrystallisedInvestigationoftheeffectofe.g.drugbindingonproteinsecondarystructureDynamicprocesses,e.g.proteinfolding

Studiesoftheeffectsofenvironmentonproteinstructure

Secondarystructureandsuper-secondarystructureofmembraneproteinsStudyofligand-inducedconformationalchangesCarbohydrateconformationInvestigationsofprotein-proteinandprotein-nucleicacidinteractionsFoldrecognitionApplicationsofCDinstructur33CD實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)CD實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)34儀器操作及參數(shù):儀器操作及參數(shù):35NitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation氮?dú)饬髁?5-20for>180nm>20for<180nmNitrogenflushingFlushingthe36溫度:圓二信號同紫外和熒光一樣對溫度十分敏感

實(shí)驗(yàn)平行體系溫度要保持一致房間空調(diào),同時(shí)儀器控溫溫度:圓二信號同紫外和熒光一樣對溫度十分敏感37圓二色譜原理與應(yīng)用ppt課件38HTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired.FurthermoretheHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance.BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible.AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel.HTplotTheHTplotisveryimp39Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butcompatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned.AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted.IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection.Tradeinofaccuracyversussensitivity(i.e.theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired.2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrialBandwidth(SBW)selectionSetti40Numberofdatapointdatapitch,i.e.numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel.Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithmNumberofdatapointdatapitch41AccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra.HeretootheS/Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations.Averagingisveryeffectivesinceitcompensatesshorttermrandomnoise,butit’llnotcompensatelongtermdrifts(mainlyofthermalorigin).Soiflongaccumulationsareusedwerecommendasuitablelongwarm-upofthesystemand/ortheuseofasamplealternator(tocollectsequentiallysampleandblankandaveragetheirsubtractedvalues).Forlongovernightaccumulationsit’sessentialthatroomtemperatureiswellkeptstable.Accumulationanotherwaytoimp42掃描速度和響應(yīng)時(shí)間:掃描速度和響應(yīng)時(shí)間對不同樣品體系可能有所不同要得到較好可重復(fù)的光譜數(shù)據(jù)必須找到合適的掃描速度和響應(yīng)時(shí)間.一般蛋白質(zhì)掃描速度:20-100nm/min響應(yīng)時(shí)間:4-8秒掃描速度和響應(yīng)時(shí)間:掃描速度和響應(yīng)時(shí)間對不同樣品體系可能有所43樣品裝備樣品裝備442.Forstubborndirtorproteins,a)YoumayuseconcentratedHNO3,aquaregiaorotheracidwash.b)DoNOTusealkali,hydrofluoricacid,orphosphoricacidonthequartzcell.Avoidscratchingthecell.c)CleanwithdistilledH2Othensoakwith2-3%sodiumlaurylsulfateforafewminutes.Rinsethoroughly(10times)withwater,thenEtOH3times,andacetone3times.3.Aftercleaning,avoidtouchingthesamplecell.Fingerprintscancauseartifactsinthedata.1.Routinecleaning.a)Washwithwaterorsolvent.b)Washwithvolatilesolvent(e.g.,acetone),thenstreamcleandryairintothecell.Thehouseairmaycontainoilssoitisrecommendedtoavoiditortouseglassfilterinapipette.二、石英杯的清洗:2.Forstubborndirtorprotei45CircularDichroismCalibrationProcedure1cmcell.0.06%(w/v)At291nm,theresultshouldbe190.4±1%,or188.5to192.3mdeg.Thisdoesnotincludederrorinmakingthecamphorstandard.1-mmcell.0.06%18.7mdegat290.5nmand238.9mdegat192.5nmAmmoniumcamphorsulfonate:solidammoniumd-camphor-10-sulfonate,FW249.33FromKATAYAMA