一種B細(xì)胞擴(kuò)增用重組蛋白CD40L及其使用方法與流程

一種B細(xì)胞擴(kuò)增用重組蛋白CD40L及其使用方法與流程引言B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑在治療免疫性疾病和癌癥方面有廣泛的應(yīng)用前景。其中可針對(duì)單一抗原的免疫療法因其治療效果特異性高而備受關(guān)注。選擇適當(dāng)高效的B細(xì)胞刺激因子，可以實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增難以識(shí)別抗原特異性B細(xì)胞，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答和治療效果。例如，使用Cd40配體（CD40L）擴(kuò)增已知的抗原特異性細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞瘤或胃腸道腫瘤的免疫治療效果顯著提高。然而，野生型CD40L的使用有時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，包括T細(xì)胞介導(dǎo)的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)。為了克服這些問(wèn)題，從人源化、CD40L的重組和優(yōu)化的研究中，開發(fā)了用于選擇性B細(xì)胞擴(kuò)增的新型CD40L重組蛋白，可以更好地控制治療劑量、減少副作用。本文將對(duì)一種B細(xì)胞擴(kuò)增用重組蛋白CD40L及其使用方法與流程進(jìn)行詳細(xì)介紹。重組蛋白CD40L的構(gòu)建人類CD40L蛋白全長(zhǎng)域（aa2-261）從人源化基因中取出，克隆到溫度敏感的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pLV-TH并進(jìn)行表達(dá)。CD40L蛋白的多聚體組裝形式通過(guò)不同的表達(dá)條件進(jìn)行了調(diào)節(jié)，在合適的熱敏感誘導(dǎo)條件下表達(dá)后得到的部分可溶峰較高，表明形成了大量高分子量且高度聚合的CD40L多聚體。最終通過(guò)柱層析技術(shù)純化出CD40L蛋白。CD40L蛋白經(jīng)大規(guī)模表達(dá)純化后，進(jìn)行毒性、微生物學(xué)和質(zhì)量分析，結(jié)果表明該蛋白的生物活性高、質(zhì)量穩(wěn)定，符合國(guó)際規(guī)范的制藥級(jí)別、臨床試驗(yàn)級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)。重組蛋白CD40L的結(jié)構(gòu)特征CD40L是一種TNF家族成員，N端存在一個(gè)一個(gè)外泌蛋白域(ECTO)，可以參與糖基化作用，同時(shí)在跨鏈錨接外泌后的CD40L中共有334個(gè)氨基酸殘基表現(xiàn)出了生物功能?？梢酝ㄟ^(guò)這些區(qū)域與CD40發(fā)生交互。具體來(lái)說(shuō)，這個(gè)蛋白的主要結(jié)構(gòu)特征為單個(gè)蛋白分子是由兩個(gè)獨(dú)立單體的非常穩(wěn)定的三聚體組成的。重組蛋白CD40L的結(jié)構(gòu)基本上是圍繞數(shù)肽（尤其是T51）和冊(cè)激活結(jié)構(gòu)（尤其是區(qū)域3，K191-R202）的相互作用維持的。在沒(méi)有CD40的情況下，CD40L/K191-R202的區(qū)域可能存在（無(wú)法通過(guò)X射線晶體技術(shù)確定）。當(dāng)CD40L和CD40（aa22-144）結(jié)合時(shí)，這些相互作用得到增強(qiáng)，CD40L-K196通過(guò)水橋接M近似與CD40-Y118的末端HC表面距離形成堿性極點(diǎn)極靠近的酸性東西，并且沒(méi)有一水橋，水橋的熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可能對(duì)CD40L/CD40結(jié)合的增強(qiáng)起到重要作用。這個(gè)結(jié)構(gòu)的揭示說(shuō)明了重組蛋白CD40L與靶分子CD40的特異性相互作用，指導(dǎo)了重組蛋白CD40L的優(yōu)化設(shè)計(jì)。重組蛋白CD40L使用的方法目前，主要應(yīng)用于CD40L的治療策略包括直接注射或基因工程B細(xì)胞等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)B細(xì)胞的選擇性激活而非對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)的刺激。用于CD40L治療的最佳途徑取決于特定疾病的治療響應(yīng)和對(duì)CD40L重組蛋白的生物學(xué)響應(yīng)，以及需要治療的特定細(xì)胞類型的可使用方法。重組蛋白CD40L的穩(wěn)定性目前有一些研究表明，重組蛋白CD40L在99℃下可以穩(wěn)定30min以上，且在冰凍和化學(xué)不和條件下也表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。相對(duì)于在37℃時(shí)失活較快的野生型CD40L，這個(gè)重組蛋白的穩(wěn)定性大大提高了其臨床應(yīng)用的可能性。重組蛋白CD40L與細(xì)胞懸液的處理在擴(kuò)增B細(xì)胞的過(guò)程中，操作人員應(yīng)當(dāng)先制備CD40L重組蛋白供使用。對(duì)于細(xì)胞處理，細(xì)胞從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出并離心，將異物和紅細(xì)胞清除，并用緩沖液重懸細(xì)胞。這個(gè)緩沖液可以是簡(jiǎn)單MM，PBS或RPMI，但是MM是最好的選擇。然后為每個(gè)實(shí)驗(yàn)制定一個(gè)不同的應(yīng)用（固相或液相）。對(duì)于液相，將每個(gè)“通孔”裝滿細(xì)胞懸液。對(duì)于固相，將96孔板中的各通道涂上所需抗原。測(cè)常量建議使用固相法。不同類型細(xì)胞的擴(kuò)增一般在液相法擴(kuò)增過(guò)程中，會(huì)根據(jù)目標(biāo)樣本不同的來(lái)源選擇合適的CD40L作為刺激劑。對(duì)于人類B細(xì)胞，較常用的是哺乳動(dòng)物的重組CD40L；對(duì)于小鼠B細(xì)胞，目前多采用融合的鼠類有癌細(xì)胞作為發(fā)酵宿主的可溶性CD40L。對(duì)于B細(xì)胞樣品的擴(kuò)增，需要在細(xì)胞外液中加入CD40L。對(duì)于單純的核酸展示庫(kù)等項(xiàng)目，CD40L一般在液相條件下作為循環(huán)加入，在一小時(shí)之內(nèi)完成擴(kuò)增。對(duì)于B細(xì)胞分選項(xiàng)目，需要將CD40L添加到混合物中，可以使用滴定法進(jìn)行處理，稀釋CD40L后依次加入到混合物中。與一般已知的B細(xì)胞活化方法（如LPS或PHA）相比，CD40L在去髓皮化上更加特異，但是仍然需要保證相應(yīng)的核酸展示庫(kù)配合CD40L進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)論重組蛋白CD40L是一種非常穩(wěn)定且結(jié)構(gòu)優(yōu)化的蛋白，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。在使用CD40L擴(kuò)增特定類型B細(xì)胞的過(guò)程中，需要根據(jù)不同類型的樣本選擇合適的CD40L