基因工程的原理

基因工程的原理基因工程的原理第1頁基因工程概念基因工程別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境操作對象操作水平基礎(chǔ)過程結(jié)果

基因工程是指按照大家愿望，將一個生物基因在體外剪切，并與特殊運載工具進(jìn)行拼接，然后導(dǎo)入另一個生物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表示產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)技術(shù)。定向改造生物遺傳性狀。DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表示定向改造了生物性狀_________________培育成功，宣告了基因工程誕生。雙重抗性大腸桿菌基因工程的原理第2頁轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲棉普通棉基因工程的原理第3頁問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一個能夠合成毒蛋白基因。讓細(xì)菌毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表示，可培育出抵抗棉鈴蟲害抗蟲棉。

想一想需要哪些工具呢？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程的原理第4頁

一、基因手術(shù)刀：限制性內(nèi)切酶

二、基因縫紉針：DNA連接酶

三、基因運輸車：載體探究1：基因工程基礎(chǔ)工具是什么？基因工程的原理第5頁（1）識別特定脫氧核苷酸序列（回文序列）；（2）并在特異性位點把雙鏈DNA分子“切割”開。主要從原核生物中分離純化

一、基因手術(shù)刀：限制性內(nèi)切酶1、起源：2、功效：3、酶切結(jié)果：形成黏性末端。4、作用實質(zhì)：特定部位磷酸二酯鍵（酶切位點）斷開基因工程的原理第6頁

EcoRⅠ黏性末端黏性末端識別特定脫氧核苷酸序列特點：中軸線兩側(cè)堿基反向?qū)ΨQ重復(fù)排列回文序列。切割位點：G、A之間斷裂化學(xué)鍵是：磷酸二酯鍵基因工程的原理第7頁限制性內(nèi)切酶對DNA分子切割A(yù)AGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAADNAABCDDNAHindⅢHindⅢ切割位點基因工程的原理第8頁AB限制酶作用是A處還是B處？A處T1234512345A基因工程的原理第9頁思索：

某DNA分子被限制性內(nèi)切酶Ⅰ切后形成1個DNA片段，有1000個堿基對，該DNA分子若被限制性內(nèi)切酶Ⅱ切后形成2個DNA片段，分別有600個堿基對和400個堿基對，若該DNA分子同時被限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅱ切割后形成2種DNA片段，分別有600個堿基對和200個堿基對。問：該DNA分子有何特點？限制性內(nèi)切酶Ⅰ有幾個酶切位點？限制性內(nèi)切酶Ⅱ有幾個酶切位點？該DNA為環(huán)狀1個2個基因工程的原理第10頁GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG雙鏈斷開不一樣起源DNA片段結(jié)合基因工程的原理第11頁1、種類：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯鍵

二、基因縫紉針：DNA連接酶2、作用部位：3、作用條件：兩個DNA分子末端堿基互補(bǔ)配對。4、功效：將兩個DNA分子“縫合”起來，恢復(fù)被限制性內(nèi)切酶切開了磷酸二酯鍵?；蚬こ痰脑淼?2頁

可把黏性末端之間縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開兩個核苷酸之間磷酸二酯鍵基因工程的原理第13頁GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG

二、基因縫紉針：DNA連接酶基因工程的原理第14頁GCTTAAAATTCG

二、基因縫紉針：DNA連接酶基因工程的原理第15頁連接酶部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵GCTTAAAATTCG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵重組DNA

二、基因縫紉針：DNA連接酶基因工程的原理第16頁DNA連接酶與DNA聚合酶比較DNA聚合酶DNA連接酶相同不一樣作用對象模板形成磷酸二酯鍵單個脫氧核苷酸DNA片斷需要不需要基因工程的原理第17頁（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保留；（2）含有多個限制酶切點，方便與外源基因連接；（3）含有一些標(biāo)識基因，便于進(jìn)篩選運載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞。（如熒光蛋白基因、抗四環(huán)素基因、抗氨芐青霉素基因）（4）對受體細(xì)胞無害質(zhì)粒，λ噬菌體衍生物，動植物病毒等

三、基因運輸車：載體2、載體必須具備條件：1、常見載體有：基因工程的原理第18頁常見載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入目標(biāo)基因一起復(fù)制有限制性內(nèi)切酶切割位點有標(biāo)識基因存在，可用含氨芐青霉素培養(yǎng)基判別基因工程的原理第19頁習(xí)題:已知標(biāo)識基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因,現(xiàn)探討某細(xì)菌質(zhì)粒中有沒有標(biāo)識基因或標(biāo)識基因是什么?請設(shè)計試驗、預(yù)期試驗結(jié)果，并得出對應(yīng)試驗結(jié)論對照組：不添加抗生素試驗組1：添加一定濃度四環(huán)素試驗組2：添加一定濃度氨芐青霉素試驗組3：添加一定濃度四環(huán)素和氨芐青霉素對照組試驗組1試驗組2試驗組3

結(jié)論預(yù)期一++++預(yù)期二++——預(yù)期三+—+—預(yù)期四+———既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因+：存活—：死亡基因工程的原理第20頁1、關(guān)于限制酶說法中，正確是（）A、限制酶是一個酶，只識別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割是G—A之間氫鍵C．限制酶普通不切割本身DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中課堂鞏固2、DNA連接酶催化反應(yīng)是()A．DNA復(fù)制時母鏈與子鏈之間形成氫鍵B．黏性末端堿基之間形成氫鍵C．兩個DNA片段黏性末端之間縫隙連接D．A、B、C都不正確基因工程的原理第21頁3、作為基因運輸工具——載體，必須具備條件及理由是()A、能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保留下來并大量復(fù)制，方便提供大量目標(biāo)基因B、含有多個限制酶切點，方便于目標(biāo)基因表示C．含有一些標(biāo)識基因，方便為目標(biāo)基因表示提供條件D、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保留，方便于進(jìn)行篩選基因工程的原理第22頁4、質(zhì)粒是基因工程最常見載體，它主要特點是()①能自主復(fù)制 ②不能自主復(fù)制 ③結(jié)構(gòu)很小 ④是蛋白質(zhì) ⑤是環(huán)狀RNA ⑥是環(huán)狀DNA ⑦能“友好”地“借居”A、①③⑤⑦B、②④⑥C．①③⑥⑦D．②③⑥⑦基因工程的原理第23頁5、在受體細(xì)胞中能檢測出目標(biāo)基因是因為()A、目標(biāo)基因上有標(biāo)識B、質(zhì)粒含有一些標(biāo)識基因C、重組質(zhì)粒能夠復(fù)制D．以上都不正確基因工程的原理第24頁（1）識別_____脫氧核苷酸序列；（2）并在___________把雙鏈DNA分子“切割”開。切開化學(xué)鍵為___________，形成___________。主要從_____生物中分離純化

一、基因手術(shù)刀：__________1、起源：2、功效：

二、基因縫紉針：_________1、功效：恢復(fù)被限制性內(nèi)切酶切開了__________。2、DNA連接酶與DNA聚合酶比較有何異同？

三、基因運輸車：_______2、載體必須具備條件？1、常見載體有：________溫故知新原核特定回文特異性位點磷酸二酯鍵限制性內(nèi)切酶DNA連接酶載體磷酸二酯鍵質(zhì)粒黏性末端基因工程的原理第25頁下列圖為DNA分子切割和連接過程。(1)EcoRI是一個

酶，其識別序列是

，切割位點是

與

之間

鍵。切割結(jié)果產(chǎn)生DNA片段末端形式為

。(2)不一樣起源DNA片段結(jié)合，在這里需要酶應(yīng)是

，此酶作用是在

與

之間形成

鍵，而起“縫合”作用。限制性內(nèi)切GAATTC鳥嘌呤脫氧核苷酸

腺嘌呤脫氧核苷酸

磷酸二酯黏性末端DNA連接酶鳥嘌呤脫氧核苷酸

腺嘌呤脫氧核苷酸

磷酸二酯基因工程的原理第26頁

一、目標(biāo)基因取得

二、重組載體構(gòu)建

三、重組載體導(dǎo)入和篩選探究2：基因工程普通程序是怎樣？

四、目標(biāo)基因表示和判定基因工程的原理第27頁1、目標(biāo)基因：基礎(chǔ)操作步驟

一、目標(biāo)基因取得在基因操作中使用外源基因。它是編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因，如胰島素基因、干擾素基因。2、取得目標(biāo)基因方法：（1）直接分離法——（2）人工合成法a.鳥槍法b.反轉(zhuǎn)錄法c.化學(xué)合成法（3）其它方法：從基因文庫取得、PCR擴(kuò)增基因工程的原理第28頁①分離程序：用限制性內(nèi)切酶將完整DNA分子切成適當(dāng)長度片段，然后經(jīng)過檢測方法挑選出所需要基因。用限制酶切斷成許多片段a.鳥槍法(散彈射擊法）核酸探針：是用放射性同位素或其它標(biāo)識物標(biāo)識核酸單鏈，含有非常特意核苷酸序列，能與DNA互補(bǔ)鏈結(jié)合，可用于特定基因檢測。②檢測方法：應(yīng)用核酸探針③擴(kuò)增：用PCR儀擴(kuò)增基因工程的原理第29頁b.反轉(zhuǎn)錄法c.化學(xué)合成法雙鏈DNA(即目標(biāo)基因)合成單鏈DNA(cDNA)目標(biāo)基因mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA核苷酸序列蛋白質(zhì)氨基酸序列結(jié)構(gòu)基因核苷酸序列化學(xué)合成推測推測目標(biāo)基因基因工程的原理第30頁質(zhì)粒目標(biāo)基因限制酶DNA連接酶重組DNA

二、重組載體構(gòu)建基因工程的原理第31頁基因表示載體構(gòu)建——關(guān)鍵質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口取得目標(biāo)基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一個限制酶

目標(biāo)基因與運載體結(jié)合過程，實際上是不一樣起源基因重組過程。

二、重組載體構(gòu)建基因工程的原理第32頁二、重組載體構(gòu)建基因表示載體組成：b、目標(biāo)基因a、開啟子c、終止子d、標(biāo)識基因e、復(fù)制原點基因工程的原理第33頁1、1997年，科學(xué)家將動物體內(nèi)能夠合成胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，而且在大腸桿菌中表示成功。請據(jù)右下列圖回答下列問題。(1)此圖表示是采取__________合成基因方法獲取__________基因過程。(2)圖中①DNA是認(rèn)為_________模板，形成單鏈DNA，在酶作用下合成雙鏈DNA，從而取得了所需要目標(biāo)基因。(3)圖中③代表

，它往往含

基因，方便對目標(biāo)基因檢測。人工目標(biāo)

信使RNA

重組DNA分子

標(biāo)識

基因工程的原理第34頁受體細(xì)胞導(dǎo)入方法微生物細(xì)胞Ca處理法動物受精卵顯微注射法植物體細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法植物受精卵花粉管通道法、基因槍法轉(zhuǎn)化——目標(biāo)基因?qū)隷________內(nèi)，而且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表示

三、重組載體導(dǎo)入和篩選2+基因工程的原理第35頁

大腸桿菌細(xì)胞最常見轉(zhuǎn)化方法是:（1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁通透性。（2）使含有目標(biāo)基因重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。（3）目標(biāo)基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，因為細(xì)菌繁殖速度非?？?，在很短時間內(nèi)就能取得大量目標(biāo)基因。

基因工程的原理第36頁農(nóng)桿菌介轉(zhuǎn)化法（導(dǎo)入植物體細(xì)胞）

花粉管通道法（導(dǎo)入植物受精卵）

顯微注射法（導(dǎo)入動物受精卵）基因工程的原理第37頁篩選出取得目標(biāo)基因重組細(xì)胞四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因經(jīng)過轉(zhuǎn)化，有細(xì)胞可能導(dǎo)入了重組載體，利用選擇性培養(yǎng)基就能夠把它們篩選出來?；蚬こ痰脑淼?8頁1、基因表示

基因表示指基因組中某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)過程。

基因表示改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平上改變。它往往是細(xì)胞形態(tài)功效改變之前改變。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯

四、目標(biāo)基因表示和判定基因工程成功標(biāo)志：目標(biāo)基因表示，進(jìn)而產(chǎn)生對應(yīng)性狀基因工程的原理第39頁——檢驗是否成功

四、目標(biāo)基因表示和判定基因工程的原理第40頁從蘇云金芽苞桿菌中提取抗蟲基因從土壤農(nóng)桿菌中提取帶有選擇性標(biāo)識質(zhì)粒同一個限制酶處理抗蟲基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌(農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入)篩選將土壤農(nóng)桿菌與棉花細(xì)胞混合培養(yǎng)侵染重組質(zhì)粒將抗蟲基因?qū)朊藁?xì)胞并整合到棉花DNA上植物組織培養(yǎng)取得抗蟲棉抗蟲棉培育流程圖基因工程的原理第41頁基因工程基礎(chǔ)原理概念圖基因工程的原理第42頁下列圖為利用生物技術(shù)取得動物乳腺反應(yīng)器和抗蟲棉過程，據(jù)圖回答：⑴在基因工程中，A表示

，假如直接從蘇云金桿菌中取得抗蟲基因，①過程使用酶區(qū)分于其它酶特點是

，B表示

。

⑵在研究過程中，研究人員首先從相關(guān)基因組中獲取了目標(biāo)基因，并采取

技術(shù)對目標(biāo)基因進(jìn)行了擴(kuò)增，然后將目標(biāo)基因與質(zhì)粒等載體組合形成了重組載體。在重組載體構(gòu)建過程中需要工具酶

。

目標(biāo)基因識別特定核苷酸序列，而且在特定位點上切割DNA分子重組DNA

PCR

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶

基因工程的原理第43頁

⑶基因表示載體構(gòu)建是基因工程關(guān)鍵，一個完整基因表示載體最少包含哪些個別?

。

⑷將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞過程中，在③過程中普通是采取

方法，在②過程中普通采取

方法，受體細(xì)胞普通是

。

⑸因為轉(zhuǎn)基因表示產(chǎn)物存在于山羊乳汁中，檢測其體內(nèi)是否出現(xiàn)藥用蛋白，在分子水平上檢測方法及結(jié)果是什么?

。

⑹要確定目標(biāo)基因（抗蟲基因）導(dǎo)入棉花細(xì)胞后，是否能穩(wěn)定遺傳并表示，需進(jìn)行檢測和判定工作，請寫出在個體水平上判定過程：