生物制藥酶工程制藥專家講座

第四章酶工程制藥生物制藥酶工程制藥專家講座第1頁(yè)國(guó)際酶工程學(xué)會(huì)（1971年）定義：

酶工程是研究和開發(fā)酶生產(chǎn)、酶分離純化、酶固定化、酶及固定化酶反應(yīng)器、酶與固定化酶應(yīng)用等工程科學(xué)。

生物制藥酶工程制藥專家講座第2頁(yè)酶工程制藥主要包含藥用酶生產(chǎn)和酶法制藥兩方面技術(shù)。藥用酶是指可用于預(yù)防和治療疾病酶。酶法制藥是指利用酶催化作用而制造出含有藥用功效物質(zhì)技術(shù)過程.藥用酶：酶法制藥：生物制藥酶工程制藥專家講座第3頁(yè)第一節(jié)概述酶是生物催化劑。是由活細(xì)胞產(chǎn)生以蛋白質(zhì)為主要成份生物催化劑，它能催化各種生物化學(xué)反應(yīng)。生物制藥酶工程制藥專家講座第4頁(yè)一、酶催化特征催化劑共同點(diǎn)量少高效；只加速可逆反應(yīng)進(jìn)程，而不改變反應(yīng)平衡點(diǎn)。都是經(jīng)過降低反應(yīng)分子活化能來加緊化學(xué)反應(yīng)速度。酶特征高效催化高度專一條件溫和生物制藥酶工程制藥專家講座第5頁(yè)1、酶專一性強(qiáng)酶專一性（specificity)：是指一個(gè)酶只能催化一個(gè)或一類結(jié)構(gòu)相同底物進(jìn)行某種類型反應(yīng)。生物制藥酶工程制藥專家講座第6頁(yè)絕對(duì)專一性(absolutespecificity)：只能作用于特定結(jié)構(gòu)底物，進(jìn)行一個(gè)專一反應(yīng)，生成一個(gè)特定結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。立體結(jié)構(gòu)特異性(stereo

specificity)：作用于立體異構(gòu)體中一個(gè)。相對(duì)專一性(relativespecificity)：作用于一類化合物或一個(gè)化學(xué)鍵。依據(jù)酶對(duì)其底物結(jié)構(gòu)選擇嚴(yán)格程度不一樣，酶專一性可大致分為以下2種類型：生物制藥酶工程制藥專家講座第7頁(yè)2、酶催化效率高

酶催化效率通常比非催化反應(yīng)高108～1020倍，比普通催化劑高107～1013倍。酶和普通催化劑加速反應(yīng)機(jī)理都是降低反應(yīng)活化能(activationenergy)。酶比普通催化劑更有效地降低反應(yīng)活化能。生物制藥酶工程制藥專家講座第8頁(yè)3、酶作用條件溫和酶催化不需要較高反應(yīng)溫度。酶催化作用普通都在常溫、常壓、pH近乎中性溫和條件下進(jìn)行，不需高溫高壓和極端pH條件。生物制藥酶工程制藥專家講座第9頁(yè)二、影響酶催化作用主要原因1、酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)影響在有足夠底物和其它條件不變情況下：

v=k[E]酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比生物制藥酶工程制藥專家講座第10頁(yè)2、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)影響[S]vVmax一級(jí)反應(yīng)

v=k[S]零級(jí)反應(yīng)

v=k[E]混合級(jí)反應(yīng)生物制藥酶工程制藥專家講座第11頁(yè)當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。[S]VVmax生物制藥酶工程制藥專家講座第12頁(yè)伴隨底物濃度增高反應(yīng)速度不再成正百分比加速；反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)。[S]VVmax生物制藥酶工程制藥專家講座第13頁(yè)當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)[S]VVmax生物制藥酶工程制藥專家講座第14頁(yè)3、pH對(duì)酶促反應(yīng)影響1.最適pH2.有效pH表現(xiàn)出酶最大活力pH值在一定pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定pH對(duì)酶作用影響機(jī)制：

1.環(huán)境過酸、過堿使酶變性失活；

2.影響酶活性基團(tuán)解離；

3.影響底物解離。0酶活性pH

pH對(duì)一些酶活性影響

胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶246810生物制藥酶工程制藥專家講座第15頁(yè)雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；因?yàn)槊副举|(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引發(fā)酶變性，從而反應(yīng)速度降低。

4、溫度對(duì)酶促反應(yīng)影響最適溫度(optimumtemperature)：酶促反應(yīng)速度最快時(shí)環(huán)境溫度。其不是酶特征性常數(shù)酶活性0.51.02.01.50102030405060溫度oC溫度對(duì)淀粉酶活性影響

生物制藥酶工程制藥專家講座第16頁(yè)5、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)影響激活劑使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾游镔|(zhì)。其中大部分是一些無機(jī)離子和小分子簡(jiǎn)單有機(jī)物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；無機(jī)離子對(duì)酶激活作用：（1）與酶分子肽鏈上側(cè)鏈基團(tuán)相結(jié)合，穩(wěn)定酶催化作用所需構(gòu)象。（2）作為底物與酶蛋白之間聯(lián)絡(luò)橋梁。（3）可能作為輔酶或輔基一個(gè)組成部分，幫助酶催化作用。生物制藥酶工程制藥專家講座第17頁(yè)使用激活劑注意激活劑對(duì)酶作用含有一定選擇性，使用不妥，會(huì)適得其反，激活劑之間有時(shí)存在拮抗現(xiàn)象。激活劑濃度有一定范圍，超出此范圍，會(huì)得到相反效果。生物制藥酶工程制藥專家講座第18頁(yè)6、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)影響——使酶必需基團(tuán)或活性部位中基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶失活物質(zhì)，稱為抑制劑（I）。（1）.不可逆抑制作用：抑制劑與酶結(jié)合（共價(jià)鍵）是不可逆。S+EESE+P

+I↓EIE—SH+ICH2COOH→E—S—CH2COOH+HI抑制作用特點(diǎn)：不可逆性抑制，抑制劑濃度越高，抑制作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)。生物制藥酶工程制藥專家講座第19頁(yè)（2）可逆抑制作用：抑制劑與酶結(jié)合是可逆。抑制程度是由酶與抑制劑之間親和力大小、抑制劑濃度以及底物濃度決定。[E]v1231.反應(yīng)體系中不加I。2.反應(yīng)體系中加入一定量不可逆抑制劑。3.反應(yīng)體系中加入一定量可逆抑制劑。生物制藥酶工程制藥專家講座第20頁(yè)[E]v不可逆抑制劑作用[E]v可逆抑制劑作用[I]→[I]生物制藥酶工程制藥專家講座第21頁(yè)①競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用：抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶結(jié)合。特點(diǎn)：1）抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)酶結(jié)合部位。2）抑制程度取決于I和S濃度以及與酶結(jié)合親和力大小。3）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)十分相同。S+EESE+P

+I↑↓EI生物制藥酶工程制藥專家講座第22頁(yè)②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用：底物和抑制劑同時(shí)與酶結(jié)合，但形成EIS不能深入轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。S+EESE+P

+I↑↓EI

+I↑EIS+[S]E+P特點(diǎn)：1）伴隨抑制劑濃度[I]增加，抑制作用增強(qiáng)。2）底物濃度增減對(duì)抑制作用不產(chǎn)生影響。3）抑制劑不改變酶對(duì)底物親和力。生物制藥酶工程制藥專家講座第23頁(yè)③反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用：I與酶和底物中間復(fù)合物結(jié)合而不與游離酶結(jié)合，從而抑制酶活性。S+EESE+P

+I↑EISE+P特點(diǎn)：1）伴隨抑制劑濃度[I]增加，抑制作用增強(qiáng)。2）底物濃度增減對(duì)抑制作用不產(chǎn)生影響。3）抑制不改變酶對(duì)底物親和力。生物制藥酶工程制藥專家講座第24頁(yè)三、酶分類與命名（一）、酶命名1、習(xí)慣名：命名標(biāo)準(zhǔn)以下－－（1.）依據(jù)酶底物命名。（2.）依據(jù)所催化反應(yīng)性質(zhì)命名。（3.）有酶結(jié)合上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)命名。（4.）在這些基礎(chǔ)上有時(shí)還加上酶起源或酶其它特點(diǎn)。生物制藥酶工程制藥專家講座第25頁(yè)2、系統(tǒng)名：要求能確切表明底物化學(xué)本質(zhì)及酶性質(zhì)，包含兩部分，即底物名稱及反應(yīng)類型，底物間用“：”分開，若底物之一是水則可略去不寫。ATP+CH3COOHADP+CH3CO~P其系統(tǒng)名為：ATP：乙酸磷酸轉(zhuǎn)移酶生物制藥酶工程制藥專家講座第26頁(yè)（二）、酶分類依據(jù)反應(yīng)性質(zhì)分為六大類1、氧化還原酶類：催化氧化還原反應(yīng)，包括H和電子轉(zhuǎn)移。如脫氫酶類。2、轉(zhuǎn)移酶類：催化分子間功效基團(tuán)轉(zhuǎn)移。如轉(zhuǎn)氨酶類。生物制藥酶工程制藥專家講座第27頁(yè)3．水解酶類：催化水解反應(yīng)。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4．裂合酶類：催化非水解地除去底物分子中基團(tuán)及其逆反應(yīng)酶。如醛縮酶脫氨酶脫羧酶生物制藥酶工程制藥專家講座第28頁(yè)5．異構(gòu)酶類：催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)變。6、合成酶：與ATP分解相偶聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一個(gè)物質(zhì)。如天冬酰胺合成酶丙酮酸羧化酶生物制藥酶工程制藥專家講座第29頁(yè)在每一大類酶中，又依據(jù)底物中被作用基團(tuán)或鍵特點(diǎn)分為若干亞類，然后再把屬于某一亞類、亞亞類酶按次序排好，這么把已知酶分門別類地排成一個(gè)表，叫做酶表。類亞類亞亞類序號(hào)生物制藥酶工程制藥專家講座第30頁(yè)如EC1.1.1.27為乳酸：NAD+氧化還原酶

EC1.1.1.37為蘋果酸：NAD+氧化還原酶

EC1.1.1.1為乙醇：NAD+氧化還原酶生物制藥酶工程制藥專家講座第31頁(yè)一些酶命名舉例生物制藥酶工程制藥專家講座第32頁(yè)四、酶活力及其測(cè)定酶定量并非對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，而是對(duì)它催化能力進(jìn)行定量。所以，酶定量就是測(cè)定酶活力，也即測(cè)定酶促反應(yīng)速度。生物制藥酶工程制藥專家講座第33頁(yè)1.酶活力及測(cè)定酶活力

是酶促反應(yīng)能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化某一化學(xué)反應(yīng)速度快慢，即酶催化反應(yīng)速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。

生物制藥酶工程制藥專家講座第34頁(yè)酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定包含兩個(gè)階段。首先要在一定條件下，將酶與其作用底物混合均勻，反應(yīng)一段時(shí)間，然后再測(cè)定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物改變量。步驟：（1）依據(jù)酶專一性，選擇適宜底物，并配置成一定濃度底物溶液。（2）依據(jù)資料或試驗(yàn)結(jié)果，確定酶催化反應(yīng)溫度、pH值等條件。（3）在一定條件下，將一定量酶液與一定量底物溶液混合均勻，統(tǒng)計(jì)開始時(shí)間。（4）反應(yīng)到一定時(shí)間，取出適量反應(yīng)液利用各種適合生化檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定產(chǎn)物生成量或底物降低許。生物制藥酶工程制藥專家講座第35頁(yè)①反應(yīng)時(shí)間一到，馬上取出一定量反應(yīng)液，置于沸水浴中，加熱使酶失活。②馬上加入適宜酶變性劑，如三氯醋酸等，使酶變性失活。③馬上加入酸或堿溶液，使反應(yīng)液pH值快速遠(yuǎn)離酶促反應(yīng)最適pH值，從而終止反應(yīng)。④將取出反應(yīng)液馬上置于冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應(yīng)液溫度快速降低到10℃以下。慣用終止酶反應(yīng)方法：生物制藥酶工程制藥專家講座第36頁(yè)2.酶活力單位

酶活力單位(1961年)：在特定條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物酶量，定義為一個(gè)酶活力單位，用U表示。

特定條件是指：溫度可采取25℃或其它選取溫度，其它條件均采取最適條件。生物制藥酶工程制藥專家講座第37頁(yè)3.酶比活力指每毫克酶蛋白所含酶活力單位數(shù)比活力＝酶活力單位數(shù)（U）酶蛋白質(zhì)量（mg）比活力是酶制劑純度慣用指標(biāo)——比活力越大，表示酶越純。生物制藥酶工程制藥專家講座第38頁(yè)第二節(jié)藥用酶生產(chǎn)

生物制藥酶工程制藥專家講座第39頁(yè)一、藥用酶種類1、蛋白酶:蛋白酶當(dāng)前可用作：(1)消化劑(2)消炎劑(3)治療高血壓生物制藥酶工程制藥專家講座第40頁(yè)α-淀粉酶水解淀粉生成糊精，是國(guó)際上廣泛使用消化藥。最早采取米曲霉生產(chǎn)復(fù)合α-淀粉酶，其中還含有蛋白酶、脂肪酶等各種酶。但因?yàn)槊浊功?淀粉酶適宜pH值為4.5~6.0所以在胃中易受胃酸破壞。用黑曲霉酸性淀粉酶作為消化藥，不易受胃酸破壞，效果會(huì)更加好。2、α-淀粉酶生物制藥酶工程制藥專家講座第41頁(yè)脂肪酶催化脂肪水解生成甘油和脂肪酸，可作為消化劑使用。

假單胞菌脂肪酶能分解血液中低密度脂白和乳糜微粒，可用于預(yù)防和治療高血脂病。3、脂肪酶生物制藥酶工程制藥專家講座第42頁(yè)該酶水解右旋糖酐生成小分子產(chǎn)物，對(duì)齲齒有顯著預(yù)防效果。齲齒是一個(gè)常見口腔疾病，其病因是因?yàn)榭谇恢屑?xì)菌將蔗糖合成結(jié)構(gòu)類似右旋糖酐粘性多糖，粘附在牙齒表面，引發(fā)細(xì)菌滋生，而使牙齒受到損壞。將右旋糖酐酶應(yīng)用到牙膏，可有效防治齲齒產(chǎn)生。4、右旋糖酐酶生物制藥酶工程制藥專家講座第43頁(yè)溶菌酶含有抗菌，消炎，鎮(zhèn)痛等療效，是一個(gè)廣泛應(yīng)用藥用酶。溶菌酶作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，使其受到破壞，而使病原菌、腐敗性細(xì)菌等溶解死亡。溶菌酶與抗生素聯(lián)合使用，可顯著提升抗生素療效.5、溶菌酶生物制藥酶工程制藥專家講座第44頁(yè)SOD催化超氧負(fù)離子（O-2）進(jìn)行氧化還原反應(yīng)生成氧和雙氧水。（2O-2+2H+→H2O2+O2）因?yàn)镾OD能去除體內(nèi)超氧負(fù)離子，含有抗氧化、抗輻射、抗衰老功效，保護(hù)機(jī)體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等免遭超氧負(fù)離子破壞，對(duì)紅斑狼瘡、皮膚炎、結(jié)腸炎、白內(nèi)障、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氧中毒等疾病有顯著療效，對(duì)輻射有防護(hù)作用。6、超氧化物歧化酶(SOD)生物制藥酶工程制藥專家講座第45頁(yè)Asn→Asp+NH3

抗癌藥品癌細(xì)胞不含天冬酰胺合成酶,本身不能合成L-天冬酰胺，而外源L-Asn又被加入L-天冬酰胺酶分解掉，所以，蛋白質(zhì)合成受阻，從而造成癌細(xì)胞死亡。7、L-天冬酰胺酶生物制藥酶工程制藥專家講座第46頁(yè)鏈激酶：β-溶血性鏈球菌產(chǎn)生一個(gè)蛋白酶，可催纖維蛋白酶原，激活成纖維蛋白酶而將纖維蛋白水解使血栓溶解。

尿激酶：從尿液中分離得到一個(gè)蛋白酶，含有溶解血栓療效，其副作用比鏈激酶小。

納豆激酶：由納豆桿菌或枯草芽孢桿菌產(chǎn)生一個(gè)蛋白酶，含有溶解血栓功效，能夠口服。

8、溶栓酶生物制藥酶工程制藥專家講座第47頁(yè)9、乳糖酶乳糖酶又稱β-半乳糖苷酶，它催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖。乳糖酶可用于治療乳糖酶缺乏癥。生物制藥酶工程制藥專家講座第48頁(yè)利用各種生化分離技術(shù)，從動(dòng)物、植物及微生物等含酶細(xì)胞、組織或器官中提取、分離和純化各種藥用酶方法稱為提取法。二、藥用酶生產(chǎn)方法1、提取法：生物制藥酶工程制藥專家講座第49頁(yè)利用各種動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞生命活動(dòng)而取得人們所需酶方法稱為生物合成法。主要是利用微生物細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。2、生物合成法：生物制藥酶工程制藥專家講座第50頁(yè)化學(xué)合成法是60年代中期出現(xiàn)新技術(shù)。

1965年，我國(guó)人工合成胰島素成功，開辟了蛋白質(zhì)化學(xué)合成新紀(jì)元。

3、化學(xué)合成法:1969年，美國(guó)首次用化學(xué)合成法得到含有124個(gè)氨基酸核糖核酸酶?；瘜W(xué)合成法合成成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)酶,至今停留在試驗(yàn)室階段。生物制藥酶工程制藥專家講座第51頁(yè)經(jīng)過篩選、誘變或采取基因工程、細(xì)胞工程等技術(shù)而取得。三、藥用酶生產(chǎn)細(xì)胞選擇用于酶發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)胞必須具備條件：1、酶產(chǎn)量高生物制藥酶工程制藥專家講座第52頁(yè)2、

輕易培養(yǎng)和管理適應(yīng)性較強(qiáng)，易于生長(zhǎng)繁殖，便于管理。3、

產(chǎn)酶穩(wěn)定性好不易退化，能穩(wěn)定地用于生產(chǎn)。4利于酶分離純化胞外酶5、安全可靠生物制藥酶工程制藥專家講座第53頁(yè)慣用產(chǎn)酶微生物有：

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）大腸桿菌（Escherichiacoli）黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusorizae）木霉（Trichoderma）青霉（penicillium）根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）鏈霉菌（Streptomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）假絲酵母（Candida）生物制藥酶工程制藥專家講座第54頁(yè)對(duì)于誘導(dǎo)酶發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)誘導(dǎo)物，可使產(chǎn)酶量顯著提升。

四、提升藥用酶產(chǎn)量辦法1、添加誘導(dǎo)物：生物制藥酶工程制藥專家講座第55頁(yè)不一樣酶有各自不一樣誘導(dǎo)物。然而有時(shí)一個(gè)誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)生成同一酶系若干種酶，如β-半乳糖苷可同時(shí)誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶、透過酶和β-半乳糖乙?；?種酶(協(xié)同誘導(dǎo))。同一個(gè)酶往往有各種誘導(dǎo)物，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可依據(jù)酶特征、誘導(dǎo)效果和誘導(dǎo)物起源等方面進(jìn)行選擇。生物制藥酶工程制藥專家講座第56頁(yè)（1）酶作用底物：乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶青霉素誘導(dǎo)青霉素酶（2）酶反應(yīng)產(chǎn)物：半乳糖醛酸誘導(dǎo)果膠酶纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶沒食子酸誘導(dǎo)單寧酶誘導(dǎo)物種類：生物制藥酶工程制藥專家講座第57頁(yè)酶最有效誘導(dǎo)物。如：IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍；蔗糖甘油單棕櫚酸酯對(duì)蔗糖酶誘導(dǎo)效果比蔗糖高幾十倍等。（3）酶底物類似物:生物制藥酶工程制藥專家講座第58頁(yè)分解代謝物阻遏阻遏作用產(chǎn)物反饋?zhàn)瓒裟┒水a(chǎn)物阻遏物酶催化反應(yīng)產(chǎn)物分解代謝物控制阻遏濃度是解除阻遏、提升酶產(chǎn)量有效辦法。2、控制阻遏物濃度生物制藥酶工程制藥專家講座第59頁(yè)

末端產(chǎn)物阻遏：可經(jīng)過控制末端產(chǎn)物濃度使阻遏解除。

酶催化反應(yīng)產(chǎn)物阻遏：可經(jīng)過控制酶催化反應(yīng)產(chǎn)物濃度使阻遏解除。解除：分解代謝物阻遏，可經(jīng)過以下方法解除：控制培養(yǎng)基中葡萄糖等輕易利用碳源濃度補(bǔ)料分次流加碳源添加一定量CAMP。生物制藥酶工程制藥專家講座第60頁(yè)陽離子型離子型陰離子型表面活性劑兩性離子型非離子型

3、添加表面活性劑生物制藥酶工程制藥專家講座第61頁(yè)因?yàn)殡x子型表面活性劑有些對(duì)細(xì)胞有毒害作用，不能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)。

非離子型表面活性劑，如Tween、Triton等，可積聚在細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞通透性，有利于酶分泌，所以可增加酶產(chǎn)量。另外，添加表面活性劑有利于提升一些酶穩(wěn)定性和催化能力。生物制藥酶工程制藥專家講座第62頁(yè)產(chǎn)酶促進(jìn)劑：是指能夠促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理并未說明清楚物質(zhì)。添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑往往對(duì)提升酶產(chǎn)量有顯著效果。4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑生物制藥酶工程制藥專家講座第63頁(yè)五、藥用酶分子修飾1、酶分子修飾：經(jīng)過各種方法使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一些改變，從而改變酶一些特征和功效過程稱為酶分子修飾。生物制藥酶工程制藥專家講座第64頁(yè)提升酶活力，增加酶穩(wěn)定性，消除或降低酶抗原性。2、酶分子修飾目標(biāo)：生物制藥酶工程制藥專家講座第65頁(yè)經(jīng)過改變酶分子中所含金屬離子，使酶特征和功效發(fā)生改變方法稱為金屬離子置換修飾，簡(jiǎn)稱為離子置換法。

3、酶分子修飾技術(shù)(方法)(1)金屬離子置換修飾：生物制藥酶工程制藥專家講座第66頁(yè)

金屬離子置換修飾法只適合用于原來在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子酶。

用于酶修飾金屬離子，往往是二價(jià)金屬離子，如：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。生物制藥酶工程制藥專家講座第67頁(yè)酶液+EDTA等金屬螯合劑→EDTA-金屬螯劑→用透析、超濾、分子篩等方法除去→失活酶液+其它金屬離子→酶活力升高，穩(wěn)定性增強(qiáng)。金屬離子置換修飾過程：生物制藥酶工程制藥專家講座第68頁(yè)例：鋅型蛋白酶→鈣型蛋白酶，酶活力提升20～30%；α-淀粉酶鎂型、鋅型→鈣型，穩(wěn)定性增強(qiáng)，酶活力提升3倍以上。生物制藥酶工程制藥專家講座第69頁(yè)利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一些精細(xì)改變，從而改變酶特征與功效方法稱為大分子結(jié)合修飾法。(2)大分子結(jié)合修飾:生物制藥酶工程制藥專家講座第70頁(yè)右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，這些大分子在使用前普通需經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。大分子修飾劑：生物制藥酶工程制藥專家講座第71頁(yè)大分子結(jié)合修飾作用：水溶性大分子經(jīng)過共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合后，可使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一些改變，使酶活性中心更有利于和底物結(jié)合，并形成準(zhǔn)確催化部位，從而使酶活力得以提升。

.例：每分子胰蛋白酶用11分子右旋糖酐修飾后，酶活力可提升30%等。①、經(jīng)過修飾提升酶活力：生物制藥酶工程制藥專家講座第72頁(yè)酶穩(wěn)定性用半衰期來表示。酶半衰期：是指酶活力降低到原來二分之一時(shí)所經(jīng)過時(shí)間。

②、經(jīng)過修飾增加酶穩(wěn)定性：用可溶性大分子與酶結(jié)合進(jìn)行酶分子修飾，可在酶外圍形成保護(hù)層，使酶空間構(gòu)象免受其它原因影響，從而增加酶穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期。生物制藥酶工程制藥專家講座第73頁(yè)③、經(jīng)過修飾降低或消除抗原性抗體與抗原之間特異結(jié)合是因?yàn)樗鼈冎g特定分子結(jié)構(gòu)所引發(fā)。采取酶分子修飾方法使酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一些改變，就有可能降低甚至消除其抗原性。例：聚乙二醇結(jié)合修飾后L-天冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。生物制藥酶工程制藥專家講座第74頁(yè)要想取得理想修飾效果，必須確定最正確修飾劑種類和濃度、溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間。生物制藥酶工程制藥專家講座第75頁(yè)（3）肽鏈有限水解修飾酶蛋白肽鏈被水解后，可能會(huì)出現(xiàn)以下3種情況中一個(gè)：①酶活性中心被破壞，失去催化功效；②肽鏈一部分水解后，仍可維持活性中心完整構(gòu)象，則酶活力仍可保持或損失不多；③肽鏈一部分水解除去以后，有利于活性中心與底物結(jié)合，酶活力提升。在后兩種情況下，肽鏈水解在限定肽鍵上進(jìn)行，稱為肽鏈有限水解。生物制藥酶工程制藥專家講座第76頁(yè)利用肽鏈有限水解，使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一些精細(xì)改變，從而改變酶特征和功效方法，稱為肽鏈有限水解修飾。肽鏈有限水解修飾：生物制藥酶工程制藥專家講座第77頁(yè)有些酶原來不顯示酶活力或酶活不高，利用一些含有高度專一性蛋白酶對(duì)它進(jìn)行肽鏈有限水解修飾，除去一部分肽段或若干個(gè)氨基酸殘基，就可使其空間構(gòu)象發(fā)生改變，有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確催化部位，從而顯示出酶催化活性或提升其酶活力。肽鏈有限水解修飾作用：①、顯示或提升酶活力生物制藥酶工程制藥專家講座第78頁(yè)有些酶原來含有抗原性，這除了酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以外，還因?yàn)槊甘谴蠓肿印５鞍踪|(zhì)抗原性與其分子大小相關(guān)，大分子外源蛋白質(zhì)往往出現(xiàn)較強(qiáng)抗原性，而小分子肽鏈或蛋白質(zhì)，其抗原性較低或者無抗原性。所以，若將酶分子經(jīng)肽鏈有限水解，其分子量減小，就會(huì)在保持其酶活力前提下，使酶抗原性降低，甚至消失。

②、降低抗原性：生物制藥酶工程制藥專家講座第79頁(yè)

酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)就是指組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上功效團(tuán)。經(jīng)過改變酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)而使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一些改變，從而引發(fā)酶特征和功效改變方法稱為酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾。

(4)酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾：生物制藥酶工程制藥專家講座第80頁(yè)①氨基修飾劑：能使酶蛋白側(cè)鏈上氨基發(fā)生改變化合物。主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、亞硝酸等。②羧基修飾劑：可與酶蛋白側(cè)鏈上羧基反應(yīng)小分子化合物。主要有：乙醇-鹽酸試劑、水溶性碳化二亞胺等

③胍基修飾劑：可與酶蛋白側(cè)鏈上胍基縮合生成穩(wěn)定雜環(huán)化合物。

普通是二羰基化合物。主要有：環(huán)己二酮、乙二醛、苯乙二醛等。慣用小分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：生物制藥酶工程制藥專家講座第81頁(yè)蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基側(cè)鏈中含有巰基。巰基在許多酶中充當(dāng)活性中心催化基團(tuán)，巰基可與另一巰基形成二硫鍵，對(duì)維持酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起主要作用。慣用有二硫蘇糖醇、疏基醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等還原劑以及各種?；瘎?、烷基化劑等。④巰基修飾劑：生物制藥酶工程制藥專家講座第82頁(yè)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上含有酚基。酚基修飾法有：碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。經(jīng)酚基修飾劑修飾后，酚分子因?yàn)橐胴?fù)電荷，因而增加了對(duì)帶正電荷底物結(jié)協(xié)力，有利于酶催化功效發(fā)揮。

⑤酚基修飾劑：⑥分子內(nèi)交聯(lián)劑：用含有雙功效團(tuán)化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等與酶分子內(nèi)兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，在分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)，可使酶分子空間構(gòu)象愈加穩(wěn)定，從而也使酶催化穩(wěn)定性增加。

生物制藥酶工程制藥專家講座第83頁(yè)（5）氨基酸置換修飾經(jīng)過氨基酸置換修飾，能夠提升酶活力或增加酶穩(wěn)定性，更有利于酶應(yīng)用。將肽鏈上某一氨基酸進(jìn)行置換而引發(fā)酶蛋白空間構(gòu)象一些改變，從而改變酶一些特征和功效，這種修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。

生物制藥酶工程制藥專家講座第84頁(yè)經(jīng)過各種物理方法，使酶分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶一些特征和功效方法稱為物理修飾。

（6）物理修飾：特點(diǎn)：不改變酶組分和基團(tuán)，酶分子中共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理方法作用下，副鍵發(fā)生一些改變和重排。生物制藥酶工程制藥專家講座第85頁(yè)第三節(jié)藥物酶法生產(chǎn)生物制藥酶工程制藥專家講座第86頁(yè)用在半合成抗生素生產(chǎn)上。催化青霉素或頭孢霉素水解生成6–氨基青霉烷酸（6–APA）或7–氨基頭孢霉酸（7–ACA）。又可催化?；磻?yīng)，由6–APA合成新型青霉素或由7–ACA合成新型頭孢霉素。一、藥品酶法生產(chǎn)中所用酶種類1、青霉素酰化酶：催化側(cè)鏈水解和合成生物制藥酶工程制藥專家講座第87頁(yè)化學(xué)反應(yīng)式生物制藥酶工程制藥專家講座第88頁(yè)不一樣起源青霉素?；笇?duì)溫度和pH值要求不一樣。同一起源青霉素酰化酶在催化水解反應(yīng)和催化合成反應(yīng)時(shí)所要求條件各不相同，尤其是pH條件相差較大，操作時(shí)要控制好。普通說來，催化水解反應(yīng)時(shí)，pH值為7.0~8.0,而催化合成反應(yīng)時(shí),pH值降低到5.0~7.0.生物制藥酶工程制藥專家講座第89頁(yè)2、β-酪氨酸酶

β-酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或鄰苯二酚生成二羥苯丙氨酸（DOPA，多巴）。多巴：一個(gè)神經(jīng)傳遞介質(zhì)，治療帕金森氏綜合癥（英國(guó)醫(yī)師Parkinson描述一個(gè)大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變老年性疾病）。β-酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴條件為：pH3.5-6.0，溫度30-55℃。另外，在催化轉(zhuǎn)化時(shí)要添加抗氧化劑，

生物制藥酶工程制藥專家講座第90頁(yè)核苷中核糖被阿拉伯糖取代能夠形成阿糖苷。阿糖苷含有抗癌和抗病毒作用。其中阿糖腺苷療效顯著。阿糖腺苷（腺嘌呤阿拉伯糖苷）可由核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷（尿嘧啶阿拉伯糖苷）轉(zhuǎn)化而成。而阿糖尿苷由尿苷（尿嘧啶核苷）經(jīng)過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化而成。3、核苷磷酸化酶：生物制藥酶工程制藥專家講座第91頁(yè)無色桿菌（Acbrcmobacterlydicus）蛋白酶能夠特異性地催化胰島素B鏈羧基末端（第30位）上AA置換反應(yīng)，由豬胰島素（Ala-30）

人胰島素（Thr-30），以增加療效。4、無色桿菌蛋白酶：AA排列次序

A8

A9A10B30人

ThrSerIleThr豬

ThrSerIleAla

生物制藥酶工程制藥專家講座第92頁(yè)5、5′-磷酸二酯酶5′-磷酸二酯酶催化核糖核酸水解生成四種5′-核苷酸，5′-核苷酸用于心臟疾病、肝臟疾病等治療。生物制藥酶工程制藥專家講座第93頁(yè)

PNP酶nNDP+RNAn

RNAn+1+pi

6、多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）PNP酶催化核苷二磷酸聚合生成多聚核苷酸。式中NDP為核苷二磷酸，RNAn和

RNAn+1分別為含有n和n+1個(gè)核苷酸多核苷酸。生物制藥酶工程制藥專家講座第94頁(yè)若以肌苷二磷酸（IDP）和胞苷二磷酸（CDP）為底物，經(jīng)過酶作用，可生成聚肌胞。聚肌胞是一個(gè)高效干擾素誘導(dǎo)劑，對(duì)慢性肝炎、帶狀皰疹、角膜炎等都有一定療效。PNP酶可由大腸桿菌等各種菌株生產(chǎn)。生物制藥酶工程制藥專家講座第95頁(yè)1、依據(jù)欲制造藥品結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇好原料、反應(yīng)步驟及所使用酶或酶系。

二、酶選擇與反應(yīng)條件優(yōu)化生物制藥酶工程制藥專家講座第96頁(yè)2、依據(jù)藥品用途和要求，選擇酶需經(jīng)過一定步驟進(jìn)行純化，以到達(dá)產(chǎn)品要求。生物制藥酶工程制藥專家講座第97頁(yè)3、依據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，確定并優(yōu)化反應(yīng)工藝條件，包含底物濃度、酶濃度、溫度、PH、激活劑濃度等。生物制藥酶工程制藥專家講座第98頁(yè)4、要求前體物質(zhì)到達(dá)一定純度要求并廉價(jià)易得，以提升產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。生物制藥酶工程制藥專家講座第99頁(yè)三、酶和菌體固定化游離酶不足：（1）酶穩(wěn)定性較差，在溫度、PH值和無機(jī)離子等外界原因影響下，輕易變性失活。（2）難于回收利用，不但使成本較高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。（3）酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，不利于產(chǎn)物提純和精制。生物制藥酶工程制藥專家講座第100頁(yè)固定化酶（ImmobilizedEnzyme）

:固定在載體上，并在一定范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)酶稱為固定化酶。將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶過程稱為酶固定化。

固定在載體上菌體或菌體碎片稱為固定化菌體，它是固定化酶一個(gè)形式。生物制藥酶工程制藥專家講座第101頁(yè)（一）酶和菌體固定化方法

吸附法包埋法共價(jià)結(jié)正當(dāng)交聯(lián)法生物制藥酶工程制藥專家講座第102頁(yè)吸附法吸附法是經(jīng)過載體表面和酶分子表面間次級(jí)鍵相互作用而到達(dá)固定目標(biāo)方法。

生物制藥酶工程制藥專家講座第103頁(yè)物理吸附法(physicaladsorption)是經(jīng)過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于不溶性載體方法。慣用載體有：高嶺土、皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微空玻璃等無機(jī)吸附劑，纖維素、膠原以及火棉膠等有機(jī)吸附劑。離子結(jié)正當(dāng)(ionbinding)是指在適宜pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶?jìng)?cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基間相互作用而到達(dá)酶固定化方法（離子鍵）。最慣用交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其它離子交換劑還有各種合成樹脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。離子交換劑吸附容量普通大于物理吸附劑。依據(jù)吸附劑特點(diǎn)分為兩種：生物制藥酶工程制藥專家講座第104頁(yè)吸附法優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，可供選擇載體類型多，吸附過程可同時(shí)到達(dá)純化和固化目標(biāo)，所得到固定化酶使用失活后能夠重新活化和再生。

缺點(diǎn)：酶和載體結(jié)協(xié)力不強(qiáng)，易脫落，會(huì)造成催化活力喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。

生物制藥酶工程制藥專家講座第105頁(yè)2、包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化方法稱為包埋法。生物制藥酶工程制藥專家講座第106頁(yè)凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部微孔中，制成一定形狀固定化酶或固定化菌體。（1）、凝膠包埋法聚丙烯酰胺包埋是最慣用包埋法它機(jī)械強(qiáng)度高，并能夠改進(jìn)酶脫落情況，在包埋同時(shí)使酶共價(jià)偶聯(lián)到高聚物上，能夠降低酶脫落。

海藻酸鈉也能夠用來作為包埋載體，它從海藻中提取出來，可被多價(jià)離子Ca2+、Al3+凝膠化，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)。

K-角叉萊膠（卡拉膠）冷卻成膠或與二、三價(jià)金屬離子成膠。包埋條件溫和無毒性，機(jī)械強(qiáng)度好。固定化酶活回收率和穩(wěn)定性都比聚丙烯酰胺法好。

膠原和明膠也是慣用包埋載體。生物制藥酶工程制藥專家講座第107頁(yè)2、微囊化包埋法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)使用。微囊制備方法（1）界面沉淀法是一個(gè)簡(jiǎn)單物理微囊化法，它是利用一些高聚物在水相和有機(jī)相界面上溶解度較低而形成皮膜將酶包埋。（2）界面聚正當(dāng)是用化學(xué)伎倆制備微囊方法。他所得微囊外觀好，但不穩(wěn)定，有些酶還會(huì)因在包埋過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失活。（3）表面活性劑乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性劑使之乳化形成液膜到達(dá)包埋目標(biāo)一個(gè)方法。

生物制藥酶工程制藥專家講座第108頁(yè)包埋法優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：在于它是一個(gè)反應(yīng)條件溫和、極少改變酶結(jié)構(gòu)不過又較牢靠固定化方法。

缺點(diǎn)：是只有小分子底物和產(chǎn)物能夠經(jīng)過高聚物網(wǎng)架擴(kuò)散，對(duì)那些底物和產(chǎn)物是大分子酶并不適合。這是因?yàn)楦呔畚锞W(wǎng)架會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力造成固定化酶動(dòng)力學(xué)行為改變，使活力降低。生物制藥酶工程制藥專家講座第109頁(yè)共價(jià)結(jié)正當(dāng)是當(dāng)前研究中最為活躍方法。

原理：借助共價(jià)鍵將酶非活性必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體功效基團(tuán)進(jìn)行偶連。3、共價(jià)結(jié)合（偶聯(lián)）法

生物制藥酶工程制藥專家講座第110頁(yè)（1）載體性質(zhì)要求載體親水，而且有一定機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫和條件下與酶結(jié)合功效基團(tuán)。

（2）偶聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)條件必須在溫和pH、中等離子強(qiáng)度和低溫緩沖溶液中。

（3）所選擇偶聯(lián)反應(yīng)要盡可能考慮到對(duì)酶其它功效基團(tuán)副反應(yīng)盡可能少。

（4）要考慮到酶固定化后構(gòu)型，盡可能降低載體空間位阻對(duì)酶活力影響。

共價(jià)偶聯(lián)法中幾個(gè)影響原因：生物制藥酶工程制藥專家講座第111頁(yè)共價(jià)偶聯(lián)法優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：得到固定化酶結(jié)合牢靠、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。