雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法-課件

雙熒光素酶報告系統(tǒng)雙熒光素酶報告系統(tǒng)報告基因(reportergene):是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達調(diào)控。在動物基因表達調(diào)控的研究中，報告基因被廣泛應(yīng)用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。一、概述報告基因(reportergene):是一種編碼可被檢測熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，哺乳細胞無內(nèi)源性熒光素酶。熒光素酶報告基因的優(yōu)點蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產(chǎn)生報告活性。在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光。檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光

構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。二、實驗原理

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（fireflyluciferase）的上游，LUC

啟動子細胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄被激活未處理對照刺激物處理啟動子-Luc轉(zhuǎn)染細胞啟動子-Luc的啟動子被激活Luc的轉(zhuǎn)錄Luc表達量測得的熒光值

同時，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等）對實驗準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinillaluciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，當(dāng)加入熒光素酶檢測試劑II(LARII)時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo?試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，同時進行第二次測量。同時，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別A．檢測前相關(guān)試劑配制

1.1XPLB裂解緩沖液配制：將4×體積水或PBS加入1×體積5XPLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X緩沖液，平衡需2-3min）。

2.LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制：將LuciferaseAssayBufferII加入LuciferaseAssaySubstrate充分混合后，分裝，置于-20℃避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復(fù)凍融），使用前將配好的LARII從-20℃拿出，并平衡至室溫（需20-30min）。三、操作程序與結(jié)果判定A．檢測前相關(guān)試劑配制三、操作程序與結(jié)果判定3.Stop&Glo?Reagent配制：現(xiàn)用現(xiàn)配，先將Stop&Glo?Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50XStop&Glo?Substrate加入49倍體積的將Stop&Glo?Buffer中。3.Stop&Glo?Reagent配制：B．樣品制備1.仔細地將生長培養(yǎng)基從待檢細胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細胞2-3次。此過程必須仔細，并盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）。2.24孔板每孔加入100-150μl1X裂解緩沖液PLB以覆蓋細胞。然后將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。B．樣品制備C．雙熒光素酶檢測（PromegaGLOMAX）(注：系統(tǒng)運行時請勿觸摸操作屏)1.重新設(shè)定系統(tǒng)：ToolsSettingsReset2.雙熒光素酶檢測程序的設(shè)定：

ProtocolsRunPromegaProtocolDLR-O-INJOK3.將50μlLARII加入1.5mlEP管中（專用的進口EP管），取10μl細胞裂解液加入裝有LARII的1.5mlEP管中，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），置于檢測儀，點擊“Measure”開始讀數(shù)（為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度）。（使用前LARII要混勻，并平衡到室溫）C．雙熒光素酶檢測（PromegaGLOMAX）4.測量結(jié)束后，取出EP管，再加入50μlStop&Glo?Reagent，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），再次置于檢測儀，點擊“Measure”開始讀數(shù)（為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度）。（Stop&Glo?Reagent現(xiàn)配現(xiàn)用，不能保存）5.記錄讀數(shù):每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1——螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度,RLU2——內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度,Ratio——RLU1/RLU2。一般記錄Ratio值即可，但RLU1和RLU2為實際熒光強度值，可以反映細胞的轉(zhuǎn)染效率，也可根據(jù)實際熒光強度來調(diào)整報告質(zhì)粒與內(nèi)參的比例。4.測量結(jié)束后，取出EP管，再加入50μlStop&6.測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后，關(guān)閉儀器。7.實驗結(jié)果的處理與分析：采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。6.測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后，關(guān)閉儀器。四、注意事項由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。Renilla熒光素酶檢測工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存。LuciferaseAssayReagentII(LARII)不能反復(fù)凍融，保證每次用同一批次的LARII。配好的LARII在-20度可穩(wěn)定一個月，在-70度可穩(wěn)定一年。四、注意事項試劑保存和使用時都應(yīng)避光。為取得最佳測定效果，測定時，樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制在相同時間內(nèi)（1-2秒）。使用過程中切勿接觸操作屏（程序會被終止或取消）。平時盡量不要移動儀器，防止觸摸屏走位。試劑保存和使用時都應(yīng)避光。ThanksForYourAttentionThanksForYourAttention歷史ⅱ岳麓版第13課交通與通訊的變化資料精品課件歡迎使用歷史ⅱ岳麓版第13課交通與通訊的變化資料精品課件歡迎使用雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件[自讀教材·填要點]一、鐵路，更多的鐵路1．地位鐵路是

建設(shè)的重點，便于國計民生，成為國民經(jīng)濟發(fā)展的動脈。2．出現(xiàn)1881年，中國自建的第一條鐵路——唐山

至胥各莊鐵路建成通車。1888年，宮廷專用鐵路落成。交通運輸開平[自讀教材·填要點]一、鐵路，更多的鐵路交通運輸開平

3．發(fā)展(1)原因：①甲午戰(zhàn)爭以后列強激烈爭奪在華鐵路的

。②修路成為中國人

的強烈愿望。(2)成果：1909年

建成通車；民國以后，各條商路修筑權(quán)收歸國有。4．制約因素政潮迭起，軍閥混戰(zhàn)，社會經(jīng)濟凋敝，鐵路建設(shè)始終未入正軌。修筑權(quán)救亡圖存京張鐵路3．發(fā)展修筑權(quán)救亡圖存京張鐵路

二、水運與航空1．水運(1)1872年,

正式成立，標(biāo)志著中國新式航運業(yè)的誕生。(2)1900年前后，民間興辦的各種輪船航運公司近百家，幾乎都是在列強排擠中艱難求生。2．航空(1)起步：1918年，附設(shè)在福建馬尾造船廠的海軍飛機工程處開始研制

。(2)發(fā)展：1918年，北洋政府在交通部下設(shè)“

”；此后十年間，航空事業(yè)獲得較快發(fā)展。輪船招商局水上飛機籌辦航空事宜處二、水運與航空輪船招商局水上飛機籌辦航空事宜處三、從驛傳到郵政1．郵政(1)初辦郵政：1896年成立“大清郵政局”，此后又設(shè)

，郵傳正式脫離海關(guān)。(2)進一步發(fā)展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驛站；1920年，中國首次參加

。郵傳部萬國郵聯(lián)大會三、從驛傳到郵政郵傳部萬國郵聯(lián)大會2．電訊(1)開端：1877年，福建巡撫在

架設(shè)第一條電報線，成為中國自辦電報的開端。(2)特點：進程曲折，發(fā)展緩慢，直到20世紀(jì)30年代情況才發(fā)生變化。3．交通通訊變化的影響(1)新式交通促進了經(jīng)濟發(fā)展，改變了人們的通訊手段和

，

轉(zhuǎn)變了人們的思想觀念。(2)交通近代化使中國同世界的聯(lián)系大大增強，使異地傳輸更為便捷。(3)促進了中國的經(jīng)濟與社會發(fā)展，也使人們的生活

。臺灣出行方式多姿多彩2．電訊臺灣出行方式多姿多彩[合作探究·提認(rèn)知]

電視劇《闖關(guān)東》講述了濟南章丘朱家峪人朱開山一家，從清末到九一八事變爆發(fā)闖關(guān)東的前塵往事。下圖是朱開山一家從山東輾轉(zhuǎn)逃亡到東北途中可能用到的四種交通工具。[合作探究·提認(rèn)知]

電視劇《闖關(guān)東》講述了濟南章丘依據(jù)材料概括晚清中國交通方式的特點，并分析其成因。

提示：特點：新舊交通工具并存(或：傳統(tǒng)的帆船、獨輪車，近代的小火輪、火車同時使用)。

原因：近代西方列強的侵略加劇了中國的貧困，阻礙社會發(fā)展；西方工業(yè)文明的沖擊與示范；中國民族工業(yè)的興起與發(fā)展；政府及各階層人士的提倡與推動。依據(jù)材料概括晚清中國交通方式的特點，并分析其成因。[串點成面·握全局][串點成面·握全局]雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件

一、近代交通業(yè)發(fā)展的原因、特點及影響1．原因(1)先進的中國人為救國救民，積極興辦近代交通業(yè)，促進中國社會發(fā)展。(2)列強侵華的需要。為擴大在華利益，加強控制、鎮(zhèn)壓中國人民的反抗，控制和操縱中國交通建設(shè)。(3)工業(yè)革命的成果傳入中國，為近代交通業(yè)的發(fā)展提供了物質(zhì)條件。一、近代交通業(yè)發(fā)展的原因、特點及影響2．特點(1)近代中國交通業(yè)逐漸開始近代化的進程，鐵路、水運和航空都獲得了一定程度的發(fā)展。(2)近代中國交通業(yè)受到西方列強的控制和操縱。(3)地域之間的發(fā)展不平衡。3．影響(1)積極影響：促進了經(jīng)濟發(fā)展，改變了人們的出行方式，一定程度上轉(zhuǎn)變了人們的思想觀念；加強了中國與世界各地的聯(lián)系，豐富了人們的生活。(2)消極影響：有利于西方列強的政治侵略和經(jīng)濟掠奪。2．特點1．李鴻章1872年在上海創(chuàng)辦輪船招商局，“前10年盈和，成為長江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立之勢”。這說明該企業(yè)的創(chuàng)辦 (

)A．打破了外商對中國航運業(yè)的壟斷B．阻止了外國對中國的經(jīng)濟侵略C．標(biāo)志著中國近代化的起步D．使李鴻章轉(zhuǎn)變?yōu)槊褡遒Y本家1．李鴻章1872年在上海創(chuàng)辦輪船招商局，“前10年盈和，成解析：李鴻章是地主階級的代表，并未轉(zhuǎn)化為民族資本家；洋務(wù)運動標(biāo)志著中國近代化的開端，但不是具體以某個企業(yè)的創(chuàng)辦為標(biāo)志；洋務(wù)運動中民用企業(yè)的創(chuàng)辦在一定程度上抵制了列強的經(jīng)濟侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D三項表述都有錯誤。答案：A解析：李鴻章是地主階級的代表，并未轉(zhuǎn)化為民族資本家；洋務(wù)運動二、近代以來交通、通訊工具的進步對人們社會生活的影響(1)交通工具和交通事業(yè)的發(fā)展，不僅推動各地經(jīng)濟文化交流和發(fā)展，而且也促進信息的傳播，開闊人們的視野，加快生活的節(jié)奏，對人們的社會生活產(chǎn)生了深刻影響。(2)通訊工具的變遷和電訊事業(yè)的發(fā)展，使信息的傳遞變得快捷簡便，深刻地改變著人們的思想觀念，影響著人們的社會生活。二、近代以來交通、通訊工具的進步對人們社會生活的影響2．清朝黃遵憲曾作詩曰：“鐘聲一及時，頃刻不少留。雖有萬鈞柁，動如繞指柔。”這是在描寫 (

)A．電話B．汽車C．電報 D．火車解析：從“萬鈞柁”“動如繞指柔”可推斷為火車。答案：D2．清朝黃遵憲曾作詩曰：“鐘聲一及時，頃刻不少留。雖雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件[典題例析][例1]

上海世博會曾吸引了大批海內(nèi)外人士利用各種交通工具前往參觀。然而在19世紀(jì)七十年代，江蘇沿江居民到上海，最有可能乘坐的交通工具是 (

)A．江南制造總局的汽車B．洋人發(fā)明的火車C．輪船招商局的輪船D．福州船政局的軍艦[典題例析][例1]上海世博會曾吸引了大批海內(nèi)外人[解析]由材料信息“19世紀(jì)七十年代，由江蘇沿江居民到上?！笨膳袛嘧钣锌赡苁禽喆猩叹值妮喆?。[答案]

C[解析]由材料信息“19世紀(jì)七十年代，由江蘇沿江居[題組沖關(guān)]1．中國近代史上首次打破列強壟斷局面的交通行業(yè)是(

)A．公路運輸 B．鐵路運輸C．輪船運輸 D．航空運輸解析：根據(jù)所學(xué)1872年李鴻章創(chuàng)辦輪船招商局，這是洋務(wù)運動中由軍工企業(yè)轉(zhuǎn)向兼辦民用企業(yè)、由官辦轉(zhuǎn)向官督商辦的第一個企業(yè)。具有打破外輪壟斷中國航運業(yè)的積極意義，這在一定程度上保護了中國的權(quán)利。據(jù)此本題選C項。答案：C[題組沖關(guān)]1．中國近代史上首次打破列強壟斷局面的交通行業(yè)是2.右圖是1909年《民呼日報》上登載的一幅漫畫，其要表達的主題是(

)A．帝國主義掠奪中國鐵路權(quán)益B．西方國家學(xué)習(xí)中國文化C．西方列強掀起瓜分中國狂潮D．西方八國組成聯(lián)軍侵略中國2.右圖是1909年《民呼日報》上登載的解析：從圖片中可以了解到各國舉的燈籠是火車形狀，20世紀(jì)初的這一幅漫畫正反映了帝國主義掠奪中國鐵路權(quán)益。B項說法錯誤，C項不能反映漫畫的主題，D項時間上不一致。答案：A解析：從圖片中可以了解到各國舉的燈籠是火車形狀，20世紀(jì)初的雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件[典題例析][例2]

(2010·福建高考)上海是近代中國茶葉的一個外銷中心。1884年，福建茶葉市場出現(xiàn)了茶葉收購價格與上海出口價格同步變動的現(xiàn)象。與這一現(xiàn)象直接相關(guān)的近代事業(yè)是(

)A．電報業(yè) B．大眾報業(yè)C．鐵路交通業(yè) D．輪船航運業(yè)[解析]材料主要反映了信息交流的快捷，故選A。[答案]

A[典題例析][例2](2010·福建高考)上海是近[題組沖關(guān)]3．假如某愛國實業(yè)家在20世紀(jì)初需要了解全國各地商業(yè)信息，可采用的最快捷的方式是 (

)A．乘坐飛機赴各地了解B．通過無線電報輸送訊息C．通過互聯(lián)網(wǎng)D．乘坐火車赴各地了解解析：本題考查中國近代物質(zhì)生活的變遷。注意題干信息“20世紀(jì)初”“最快捷的方式”，因此應(yīng)選B，火車速度遠不及電報快。20世紀(jì)30年代民航飛機才在中國出現(xiàn)，互聯(lián)網(wǎng)出現(xiàn)在20世紀(jì)90年代。答案：B[題組沖關(guān)]3．假如某愛國實業(yè)家在20世紀(jì)初需要了解全國各地4．下列不屬于通訊工具變遷和電訊事業(yè)發(fā)展影響的是(

)A．信息傳遞快捷簡便B．改變著人們的思想觀念C．阻礙了人們的感情交流D．影響著人們的社會生活解析：新式通訊工具方便快捷，便于人們感情的溝通和交流。答案：C4．下列不屬于通訊工具變遷和電訊事業(yè)發(fā)展影響的是()雙熒光素酶系統(tǒng)實驗操作步驟及方法_課件關(guān)鍵詞——交通和通訊不斷進步、辛亥革命和國民大革命順應(yīng)