免疫細(xì)胞的分類與分離

免疫細(xì)胞的分類與分離免疫細(xì)胞的分類與分離第1頁

第一節(jié)免疫細(xì)胞分類與分離一、免疫細(xì)胞種類與特征二、免疫細(xì)胞分離技術(shù)三、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇免疫細(xì)胞的分類與分離第2頁免疫細(xì)胞特征1、免疫細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征理化性狀生物學(xué)特征2、免疫細(xì)胞膜分子特征

CD分子免疫細(xì)胞的分類與分離第3頁

免疫細(xì)胞起源與分化

紅細(xì)胞血小板肥大細(xì)胞中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞漿細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞免疫細(xì)胞的分類與分離第4頁免疫細(xì)胞分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其它分離法免疫細(xì)胞的分類與分離第5頁密度梯度離心法離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細(xì)胞分離液血漿單個(gè)核細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞免疫細(xì)胞的分類與分離第6頁沉降速度=2r2（Q—Q0）9

xgQ=顆粒比重Q0=溶質(zhì)比重r=顆粒半徑

=形狀因子=顆粒摩擦系數(shù)/同體積球型顆粒摩擦系數(shù)

=粘稠度g=相對(duì)離心力免疫細(xì)胞的分類與分離第7頁人類血液有形成份平均密度與直徑

密度直徑（

）血小板1.04—1.06淋巴細(xì)胞1.06—1.088—10粒細(xì)胞1.08—1.0913紅細(xì)胞1.09—1.107.5免疫細(xì)胞的分類與分離第8頁黏附分離法尼龍毛法貼壁法親和板法吸附柱法免疫細(xì)胞的分類與分離第9頁熒光激活分離法（FACS）熒光檢測器濾光片透鏡接物鏡激光束偏轉(zhuǎn)板噴嘴細(xì)胞搜集管流體護(hù)套樣品免疫細(xì)胞的分類與分離第10頁流式細(xì)胞儀免疫細(xì)胞的分類與分離第11頁磁性分離法磁鐵吸引法磁式細(xì)胞分類術(shù)法免疫細(xì)胞的分類與分離第12頁MACS(陽性選擇法）NS免疫細(xì)胞的分類與分離第13頁MACS(陰性選擇法）NS免疫細(xì)胞的分類與分離第14頁免疫細(xì)胞的分類與分離第15頁其它分離法花環(huán)沉降法細(xì)胞活化克隆法MHC分子四聚體法免疫細(xì)胞的分類與分離第16頁抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)T免疫細(xì)胞的分類與分離第17頁細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存原理與方法細(xì)胞復(fù)蘇原理與方法免疫細(xì)胞的分類與分離第18頁細(xì)胞凍存罐免疫細(xì)胞的分類與分離第19頁

第二節(jié)免疫細(xì)胞膜分子檢測一、免疫細(xì)胞膜分子檢測原理與類型二、免疫細(xì)胞膜分子檢測方法免疫細(xì)胞的分類與分離第20頁免疫細(xì)胞膜分子檢測原理與類型1、以抗體識(shí)別抗原2、以配體識(shí)別受體免疫細(xì)胞的分類與分離第21頁免疫細(xì)胞膜分子主要檢測方法1、免疫標(biāo)識(shí)檢測方法熒光抗體法酶免疫檢測法免疫金銀染色法2、補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）3、花環(huán)形成試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第22頁SmIg熒光抗體檢測法免疫細(xì)胞的分類與分離第23頁SmIg酶免疫檢測法免疫細(xì)胞的分類與分離第24頁補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）染料補(bǔ)體免疫細(xì)胞的分類與分離第25頁E-花環(huán)T細(xì)胞B細(xì)胞花環(huán)形成細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞免疫細(xì)胞的分類與分離第26頁免疫細(xì)胞的分類與分離第27頁EA-花環(huán)免疫細(xì)胞的分類與分離第28頁EAC-花環(huán)免疫細(xì)胞的分類與分離第29頁

第三節(jié)免疫細(xì)胞功效測定一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)二、細(xì)胞毒試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)四、細(xì)胞吞噬與殺傷試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第30頁1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)2、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第31頁免疫細(xì)胞的分類與分離第32頁放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理示意免疫細(xì)胞的分類與分離第33頁1、T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒試驗(yàn)2、NK活性測定3、ADCC作用測定細(xì)胞毒檢測試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第34頁放射性測定細(xì)胞毒試驗(yàn)原理示意靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞分離上清免疫細(xì)胞的分類與分離第35頁1、直接溶血空斑試驗(yàn)2、間接溶血空斑試驗(yàn)3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)抗體形成試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第36頁直接溶血空斑試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第37頁間接溶血空斑試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第38頁SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第39頁1、細(xì)胞吞噬功效試驗(yàn)2、細(xì)胞殺菌功效試驗(yàn)細(xì)胞吞噬與殺傷功效試驗(yàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第40頁免疫細(xì)胞的分類與分離第41頁吞噬百分率=吞有顆粒吞噬細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)吞噬細(xì)胞數(shù)吞噬指數(shù)=吞噬細(xì)胞吞噬總顆粒數(shù)計(jì)數(shù)吞噬細(xì)胞數(shù)免疫細(xì)胞的分類與分離第42頁NBT還原試驗(yàn)原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲月簪基（紫黑色）免疫細(xì)胞的分類與分離第43頁NBT還原試驗(yàn)方法：1、抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細(xì)胞7.5-15%免疫細(xì)胞的分類與分離第44頁

第四節(jié)免疫細(xì)胞凋亡測定一、細(xì)胞凋亡概念與原理二、細(xì)胞凋亡檢測方法免疫細(xì)胞的分類與分離第45頁

細(xì)胞凋亡概念與原理1、細(xì)胞凋亡概念2、細(xì)胞凋亡原理3、細(xì)胞凋亡特點(diǎn)免疫細(xì)胞的分類與分離第46頁

細(xì)胞凋亡（apoptosis）

細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生主動(dòng)死亡過程，也稱程序性死亡。免疫細(xì)胞的分類與分離第47頁

細(xì)胞凋亡過程凋亡信號(hào)——凋亡受體——信號(hào)傳導(dǎo)——凋亡基因開啟——編碼程序性死亡蛋白——細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體——細(xì)胞凋亡免疫細(xì)胞的分類與分離第48頁

細(xì)胞凋亡機(jī)制免疫細(xì)胞的分類與分離第49頁

細(xì)胞凋亡特點(diǎn)1、細(xì)胞皺縮2、染色質(zhì)邊集3、凋亡小體出現(xiàn)免疫細(xì)胞的分類與分離第50頁

細(xì)胞凋亡免疫細(xì)胞的分類與分離第51頁

細(xì)胞凋亡檢測方法1、形態(tài)觀察法2、生化檢測法3、流式細(xì)胞儀檢測法免疫細(xì)胞的分類與分離第52頁形態(tài)觀察法普通光鏡檢測——HE染色甲基綠-派諾寧染色熒光顯微鏡檢測——溴化丙錠染色透射電鏡檢測——經(jīng)典形態(tài)改變免疫細(xì)胞的分類與分離第53頁生化檢測法凝膠電泳法原位末端標(biāo)識(shí)法二苯胺分光光度法免疫細(xì)胞的分類與分離第54頁凝膠電泳法原理：斷裂DNA在凝膠中呈梯形排列（DNAladder）方法：提取總DNADNA凝膠電泳觀察DNAladder現(xiàn)象免疫細(xì)胞的分類與分離第55頁原位末端標(biāo)識(shí)法（TUNEL）原理：利用標(biāo)識(shí)dUTP，在TdT作用下結(jié)合DNA斷片3’末端羥基，顯示斷鏈DNA，提醒凋亡方法：制備組織切片標(biāo)識(shí)物結(jié)合標(biāo)識(shí)物顯色鏡檢免疫細(xì)胞的分類與分離第56頁二苯胺分光光度法原理：細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，經(jīng)過超速離心可與細(xì)胞核高分子量DNA分離，分別測定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解細(xì)胞

13000g超速離心分別提取DNA

使DNA顯色，測定免疫細(xì)胞的分類與分離第57頁凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值免疫細(xì)胞的分類與分離第58頁流式細(xì)胞儀法原理：PI標(biāo)識(shí)凋亡細(xì)胞，經(jīng)過FACS可顯示凋亡細(xì)胞特征性亞二倍體峰