凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座

凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)

凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第1頁(yè)【目標(biāo)】掌握凝膠層析基本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)試驗(yàn)技能凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第2頁(yè)

【原理】

凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠分子篩作用，依據(jù)被分離物質(zhì)分子大小不一樣來(lái)進(jìn)行分離技術(shù)。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第3頁(yè)

凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離技術(shù)，又稱之凝膠過(guò)濾、分子篩層析或排阻層析。單個(gè)凝膠珠本身象“篩子”。不一樣類型凝膠篩孔大小不一樣。凝膠過(guò)濾層析凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第4頁(yè)帶網(wǎng)孔葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第5頁(yè)凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第6頁(yè)總結(jié)：相對(duì)分子質(zhì)量較大物質(zhì)因?yàn)橹睆酱笥谀z網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外空間向下流動(dòng)，所以流程較短，移動(dòng)速度快；所以首先流出。相對(duì)分子質(zhì)量較小物質(zhì)因?yàn)橹睆叫∮谀z網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，所以流程較長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢；所以最終流出。中等大小分子，它們?cè)谀z顆粒內(nèi)外部分滲透，滲透程度取決于它們分子大小，所以它們流出時(shí)間介于二者之間，這么分子大組分先流出，分子小組分后流出。這么樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小次序依次流出，從而到達(dá)了分離目標(biāo)。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第7頁(yè)【試驗(yàn)器材】層析柱恒流泵紫外檢測(cè)儀部分搜集器試管等普通玻璃器皿凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第8頁(yè)凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第9頁(yè)凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第10頁(yè)凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第11頁(yè)凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第12頁(yè)【試驗(yàn)試劑】待分離樣品葡聚糖凝膠SephadexG-100洗脫液：0.1mol/LpH6.8磷酸緩沖液凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第13頁(yè)【操作方法】一、凝膠處理

SephadexG-100干粉經(jīng)蒸餾水室溫充分溶脹48h，或沸水浴中煮沸2h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆?？障吨锌諝狻?/p>

凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第14頁(yè)二、裝柱

關(guān)閉出口，向柱內(nèi)加入洗脫液約1cm高，將濃漿狀凝膠遲緩地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約1㎝高度后打開(kāi)出水口，繼續(xù)加入凝膠漿，直到凝膠沉積至一定高度即可。裝柱要求連續(xù)，均與，無(wú)氣泡，無(wú)“紋路”。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第15頁(yè)三、平衡將洗脫液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍柱床體積洗脫液平衡，流速為0.5ml/min。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第16頁(yè)四、加樣與洗脫將柱中多出液體放掉出，使液面剛好蓋過(guò)凝膠，關(guān)閉出口，將1ml樣品沿層析柱管壁小心加入，加完后打開(kāi)底端出口，使液面降至與凝膠面相平時(shí)關(guān)閉出口，加洗脫液至液層4cm左右，接上恒流泵，開(kāi)始洗脫（0.5ml/min）。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第17頁(yè)五、搜集與測(cè)定用部分搜集器搜集洗脫液。紫外檢測(cè)儀280nm處檢測(cè)，將檢測(cè)信號(hào)輸入色譜工作站系統(tǒng)，繪制洗脫曲線。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第18頁(yè)六、凝膠柱處理凝膠用過(guò)后，重復(fù)用蒸餾水經(jīng)過(guò)柱（2~3倍床體積）即可。凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)專家講座第19頁(yè)注意事項(xiàng)各接頭不能漏氣，連續(xù)用小乳膠管不要有破損，不然造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶?jī)?nèi)排氣管應(yīng)無(wú)液體，并伴隨柱下口溶液流出不停有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過(guò)程中，層析柱內(nèi)液面不停下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢驗(yàn)并加以糾正。一直保持柱內(nèi)