克氏原螯蝦產(chǎn)植酸酶菌株的篩選

克氏原螯蝦產(chǎn)植酸酶菌株的篩選

種植酸是各種植物組織中磷的主要儲(chǔ)存形式，不能被單胃動(dòng)物消化。飼料中沒(méi)有被充分利用的磷，排泄進(jìn)入環(huán)境會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化克氏原螯蝦Procambarusclarkii（俗稱小龍蝦）是重要的淡水特色水產(chǎn)品，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。本研究從小龍蝦腸道中分離產(chǎn)植酸酶菌株，篩選出了產(chǎn)酶兼抑菌特性的潛在益生菌，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵制成同時(shí)含有植酸酶和菌體活細(xì)胞的產(chǎn)品，促進(jìn)開(kāi)發(fā)小龍蝦新型飼料添加劑以及植酸酶在水產(chǎn)中的運(yùn)用。1材料和方法1.1試劑及培養(yǎng)基配方主要原料及試劑：小龍蝦購(gòu)于某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；麩皮購(gòu)于淘寶綠牧生態(tài)養(yǎng)殖店；植酸鈣、植酸鈉、鉬酸銨、偏釩酸銨、無(wú)水乙酸鈉等化學(xué)試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母膏等培養(yǎng)基成分購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司。(1）產(chǎn)酶固體篩選培養(yǎng)基：葡萄糖30g，胰蛋白胨25g，植酸鈣5g，瓊脂20g,NH(2）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g，酵母膏5g，胰蛋白胨20g,NH(3）固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50g，蒸餾水35mL，胰蛋白胨0.75g,NH1.2方法1.2.1革蘭氏染色及生物學(xué)鑒定無(wú)菌解剖小龍蝦，取消化道剪碎后制成懸液，涂布在篩選平板上，37℃培養(yǎng)48～72h。挑取有水解圈的菌落進(jìn)行復(fù)篩、純化和保藏，進(jìn)行革蘭氏染色和分子生物學(xué)鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，通用引物為27F與1492R,PCR條件為：94℃預(yù)變性5min;30個(gè)循環(huán)（94℃變性1min,53℃退火1min,72℃延伸1.5min);72℃延伸10min。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。1.2.2植物酸酶活性測(cè)定按照GB/T18634-20091.2.3eromraphila活性細(xì)胞培養(yǎng)液抑菌圈直徑測(cè)定副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus和嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila培養(yǎng)液稀釋10倍，分別取400μL涂布平板。分別取Z4、Z11無(wú)細(xì)胞上清液以及發(fā)酵菌液，以250μL注入牛津杯，于合適溫度下培養(yǎng)48h，測(cè)定其抑菌圈直徑。以無(wú)菌蒸餾水作為對(duì)照。1.2.4溫度和ph對(duì)粗酶液與底物酶活力的影響液體發(fā)酵培養(yǎng)22h的Z11菌液，10000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液。將粗酶液與底物分別在不同溫度（30℃、35℃、37℃、40℃、45℃和50℃）及不同pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.5）條件下反應(yīng)，測(cè)定其酶活力，其中pH4.5～6.5采用乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH7.0～8.5采用Tris-HCl緩沖液。將不同金屬鹽（CaCl1.2.5為固發(fā)創(chuàng)造條件的優(yōu)化(1）單因素試驗(yàn)：初始條件為：添加0.03%的MgSO(2）正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L2結(jié)果與分析2.1克雷伯氏菌屬?gòu)男↓埼r腸道中共分離出8株產(chǎn)植酸酶菌株，其水解圈直徑/菌落直徑（D/d）見(jiàn)表1。16SrDNA分析顯示：Z2為寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas,Z5為頭狀葡萄球菌Staphylococcuscapitis,Z3、Z6、Z8、Z9為克雷伯氏菌屬Klebsiellapneumoniae,Z4與Z11為蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus。已有研究表明，蠟樣芽孢桿菌為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的潛在益生菌由表2可知：在菌體濃度為102.2z11所產(chǎn)植酸酶的最適溫度由圖1可知，無(wú)機(jī)磷濃度與吸光度間線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.2703x-0.0341,R由圖2可知，Z11所產(chǎn)植酸酶的最適溫度為35～37℃，與大部分報(bào)道的芽孢桿菌植酸酶最適溫度在55℃左右不同由圖4可知，與大量研究一致2.3菌種接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖5可知，發(fā)酵36h時(shí)，Z11菌數(shù)和所產(chǎn)酶的活性達(dá)最高值。發(fā)酵前期營(yíng)養(yǎng)條件充足，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖迅速，開(kāi)始產(chǎn)植酸酶，并隨著菌數(shù)增長(zhǎng)植酸酶活性也增長(zhǎng)，而36h后，細(xì)菌逐漸進(jìn)入衰亡期，菌數(shù)和酶活迅速下降，其產(chǎn)酶模式為同步合成型。與其他芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵不同由圖6可知，34℃時(shí)Z11菌數(shù)達(dá)最大值，而酶活在30℃最高，到34℃略有下降，這與許多報(bào)道一致，細(xì)菌的最適產(chǎn)酶溫度略低于其最適生長(zhǎng)溫度由圖7可知，接種量為3%～7%時(shí)，酶活力平緩上升，而菌數(shù)則顯著上升，接種量為7%時(shí)菌數(shù)和酶活力最優(yōu)。接種量過(guò)高時(shí)，其所需營(yíng)養(yǎng)大于培養(yǎng)基所能提供的營(yíng)養(yǎng)，菌體活力下降，酶產(chǎn)量也隨之減少。由圖8可知，硫酸鎂添加量對(duì)Z11菌數(shù)影響不大，基本都維持在102.4植酸酶活最優(yōu)配比的確定綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、硫酸鎂添加量4個(gè)因素各選擇3個(gè)水平，設(shè)計(jì)了L由表4可知，以植酸酶活力為考察指標(biāo)，極差R值大小順序?yàn)椋篟綜合酶活力與菌數(shù)兩個(gè)指標(biāo)考慮，由于發(fā)酵時(shí)間與溫度對(duì)酶活力影響均顯著，而對(duì)菌數(shù)影響均不顯著，故選擇其對(duì)酶活的最優(yōu)組合A由表6可知：A麩皮富含植酸鹽，有利于誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)菌植酸酶