第07章 蛋白質的分離、純化和表征

南昌大學生命科學院李思光

生物化學網(wǎng)絡教程蛋白質的分離、純化和表征章節(jié)目錄一、蛋白的酸堿性質二、蛋白質分子的大小與形狀三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀四、蛋白質分離純化的一般原則五、蛋白質的分離純化方法蛋白質分子由氨基酸組成，在蛋白質分子中保留著游離的末端α-氨基和α-羧基以及側鏈上的各種功能團。因此蛋白質的化學和物理化學性質有些是氨基酸相同的，例如，側鏈上功能團的化學反應，分子的兩性電解質等。蛋白質和游離氨基酸中相應基團的pKa值不完全相同天然球狀蛋白質的可解離基團大多數(shù)可被滴定，某些天然蛋白質有一些可解離基團由于埋藏在分子內部或參與氫鍵形成而不能被滴定蛋白質的等離子點：在沒有其他鹽類干擾時，蛋白質質子供體基團解離出來的質子數(shù)與質子受體基團結合的質子數(shù)相等時的pH一、蛋白的酸堿性質蛋白質是一類兩性電解質，能和酸或堿發(fā)生作用。蛋白質的等電點：蛋白質所帶正電荷與負電荷恰好相等時的pH。蛋白質的滴定曲線形狀和等電點，在有中性鹽存在下可以發(fā)生明顯變化（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量（二）滲透壓法測定相對分子質量（三）蛋白質的擴散和擴散系數(shù)（四）沉降分析法測定相對分子質量（五）凝膠過濾法測定相對分子質量（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質量RTMr=———lim—πcc→0Mr=————RTsD（1-vρ）-二、蛋白質分子的大小與形狀（一）蛋白質的膠體性質蛋白質溶液是一種分散系統(tǒng)。蛋白質溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相當穩(wěn)定的。蛋白質溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有丁達爾效應、布郎運動以及不能通過半透膜等性質。（二）蛋白質的沉淀鹽析法使蛋白質脫去水化層有機溶劑沉淀法使蛋白質脫去水化層、降低介電常數(shù)重金屬鹽沉淀法pH大于pI時，蛋白質顆粒帶負電荷，容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而沉淀。生物堿試劑和某些酸類沉淀法pH小于pI時，蛋白質顆粒帶正電荷，容易生物堿試劑和酸類的酸根負離子發(fā)生反應生成不溶性鹽而沉淀。加熱變性沉淀法三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀

前處理

粗分級分離

細分級分離（一）分離純化某一特定蛋白質的一般程序動物組織和細胞：電動搗碎機或勻漿器破碎、或超聲波破碎植物組織和細胞：石英砂或玻璃粉研磨、或纖維素酶處理細菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法有些蛋白質提取液體積較大，可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥進行濃縮凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析必要時，還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦結晶四、蛋白質分離純化的一般原則（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法（三）根據(jù)電荷不同的純化方法（四）利用選擇性吸附的純化方法（五）利用對配體的特異生物學親和力的純化方法（六）高效液相層析和快速蛋白質液相層析透析和超過濾、密度梯度離心、凝膠過濾等電點沉淀和pH控制、有機溶劑