硅膠柱層析技術(shù)

硅膠柱層析技術(shù)第1頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。其實(shí)硅膠柱層析技術(shù)也可以稱作硅膠吸附柱色譜技術(shù)第2頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜法，又稱層析法。是一種以分配平衡為機(jī)理的分配方法。色譜體系包含兩個(gè)相，一個(gè)是固定相，一個(gè)是流動(dòng)相。當(dāng)兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，反復(fù)多次的利用混合物中所含各組分分配平衡性質(zhì)的差異，最后達(dá)到彼此分離的目的。色譜法按固定相的狀態(tài)可分為柱色譜、平板色譜和棒色譜三種，而實(shí)驗(yàn)室中最常用的是柱層析和薄層層析，以及它們之間的配合應(yīng)用。第3頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月柱層析1、吸附色譜的原理在一定條件下，硅膠與被分離物質(zhì)之間產(chǎn)生作用，這種作用主要是物理和化學(xué)作用兩種。物理作用來自于硅膠表表面與溶質(zhì)分子之間的范德華力；化學(xué)作用主要是硅膠表面的硅羥基與待分離物質(zhì)之間的氫鍵作用。2、操作步驟2.1硅膠準(zhǔn)備硅膠一般選用250-400目(即40-63μm直徑的硅膠顆粒)，根據(jù)ΔRf選用硅膠的用量。2.2實(shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)備一支玻璃色譜柱,一個(gè)鐵架臺(tái),燒杯,錐形瓶,徑口直徑較大的玻璃漏斗,一支玻璃棒,等。第4頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3裝柱2.3.1吸附劑的加入①干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動(dòng)管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時(shí)使用的流動(dòng)相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞，加入適量的流動(dòng)相，旋開活塞使流動(dòng)相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤(rùn)濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。②濕法：將吸附劑與流動(dòng)相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動(dòng)相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。俟填裝吸附劑所用流動(dòng)相從色譜柱自然流下，液面將與柱表面相平時(shí)，即加試樣溶液。第5頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3.2試樣的加入①將試樣溶于層析時(shí)使用的流動(dòng)相中，再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起。②或?qū)⒃嚇尤苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲?，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。第6頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4洗脫除另有規(guī)定外，通常按流動(dòng)相洗脫能力大小，遞增變換流動(dòng)相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時(shí)，再改變流動(dòng)相的品種和比例。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。2.5檢測(cè)2.5.1初步檢測(cè)當(dāng)沖洗溶劑流出一定量后，可對(duì)流出液進(jìn)行初步檢測(cè)，并且將錐形瓶更換成小試管進(jìn)行收集。一般只進(jìn)行初步的快捷檢測(cè)，因此通常是取一小薄層板，用鉛筆和直尺將硅膠板分劃成多個(gè)小方塊，并按一定的次序編號(hào)。取一根內(nèi)徑為0.3mm左右的玻璃毛細(xì)管蘸取少量流出液，點(diǎn)于薄層板的一個(gè)小格內(nèi)，待半點(diǎn)干后，然后用物理的或化學(xué)的方法檢測(cè)。第7頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.5.2正式檢測(cè)①點(diǎn)樣:取分部收集的沖洗溶液進(jìn)行分別直接點(diǎn)樣,如果沖洗溶液太稀,濃度太小,可先濃縮.點(diǎn)樣的容器一般用玻璃毛細(xì)管,點(diǎn)樣斑點(diǎn)的直徑一般為3-5mm.②展開:在普通的展開槽中進(jìn)行,展開方式常選用上行展開.③展開劑:使用沖洗溶液.④顯色:一般常用物理檢測(cè)法和化學(xué)檢測(cè)法.物理檢測(cè)法中首先有紫外光法,紫外光常用兩種波長(zhǎng)(254nm與365nm).其次是碘蒸氣顯色法.化學(xué)檢出法通常驚醒顯色劑直接噴霧.顯色劑有通用顯色劑和專用顯色劑.通用顯色劑最常見的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,噴霧后,有的化合物立即反應(yīng),但多數(shù)化合物需加熱后經(jīng)歷數(shù)分鐘才顯色,不同化合物的反應(yīng)不同,所以顏色也往往不同.專用顯色劑是指對(duì)某個(gè)或某一類化合物顯色的試劑,利用化合物本身的特有性質(zhì),或利用其所含的某些官能團(tuán)的特殊反應(yīng).展開后根據(jù)斑點(diǎn)的,可以粗略的估計(jì)待分離物的含量的大小.第8頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6合并根據(jù)上面薄層檢測(cè)的結(jié)果,我們可以將具有相同Rf值的部分進(jìn)行合并,然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)合并部分進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后得到我們需要的目標(biāo)產(chǎn)物.2.7色譜柱的洗滌在絕大多數(shù)情況下,硅膠分離柱中的硅膠是一次性使用,但在使用后的色譜柱中由于還含有沖洗溶劑,所以要將里面的硅膠到出是比較困難的.取出硅膠的一種方法是將該柱放置一段時(shí)間,讓溶劑自然揮發(fā)完后,倒出硅膠.但這種方法既費(fèi)時(shí)又污染環(huán)境.第二種方法可以用一根比色譜柱稍長(zhǎng)的木桿或塑料桿將含有溶劑的硅膠一段一段地掏出,但這種辦法也比較麻煩.第三種方法時(shí)利用一個(gè)一般地真空泵,將柱中剩余的溶劑進(jìn)行減壓抽出,在色譜柱和真空泵之間加一個(gè)冷阱,這樣抽出地溶劑既進(jìn)行了有效地收集而不污染環(huán)境,而色譜柱中地硅膠又能較快得到干燥,使硅膠能夠方便地倒出.第9頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月3、色譜柱的選擇柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動(dòng)速度，減少產(chǎn)品收集的時(shí)間，但是會(huì)減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時(shí)候，常壓柱是效率最高的，但是時(shí)間也最長(zhǎng)，比如天然化合物的分離，一個(gè)柱子幾個(gè)月也是有的。①減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會(huì)使溶劑揮發(fā)（有時(shí)在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時(shí)使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時(shí)間長(zhǎng)）。②加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會(huì)減低分離效果。③常壓柱色譜，又稱柱層析，是色譜法中最常見的一種。它的突出優(yōu)點(diǎn)是，分離效率比經(jīng)典的化學(xué)分離方法高的多，與其他色譜法相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，更換流動(dòng)相和吸附劑方便，消耗材料少，成本低，適合分離取樣量從克到微克級(jí)范圍很寬的各種樣品，因此在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中至今仍被廣泛應(yīng)用。第10頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月4溶劑的選擇溶劑的選擇也許是整個(gè)柱色譜分離操作中最困難之處,也是實(shí)驗(yàn)成功的最關(guān)鍵之處.溶劑通常先利用簡(jiǎn)便的硅膠薄層色譜進(jìn)行篩選.4.1薄層色譜點(diǎn)樣把樣品溶解在一種低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑中(如氯仿,丙酮.甲醇.乙醇等)然后用毛細(xì)管或微量點(diǎn)樣管將試液點(diǎn)到薄層板上.點(diǎn)樣量要適當(dāng),一般點(diǎn)樣量少些,則分離叫清晰.但要注意到檢測(cè)靈敏度.4.2展開4.2.1展開劑選擇選擇展開劑時(shí),可采用微量圓環(huán)法和小型色譜法進(jìn)行選擇.第11頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月①微量圓環(huán)法:將欲分離的物質(zhì),按常規(guī)方法點(diǎn)在薄板,兩點(diǎn)相距2-3cm,再用毛細(xì)管吸取所實(shí)驗(yàn)的溶劑系統(tǒng),垂直放于樣點(diǎn)中心,讓溶劑自毛細(xì)管中依中立流出進(jìn)行展開,干燥后顯色.觀察斑點(diǎn)的分離情況.背試物質(zhì)為未知化和物時(shí),常先用低極性溶劑展開,如式樣留在圓點(diǎn)不動(dòng),則需增加溶劑的極性或增大洗脫液的量,如移動(dòng)過快,則必須用較低極性的溶劑來調(diào)整.②小型色譜法.用普通的載薄片制成薄板,把欲分離的物質(zhì)點(diǎn)載薄板上,放于小型玻璃缸或廣口瓶中展開,干燥后顯色,觀察斑點(diǎn)分離情況.第12頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2.2展開薄層色譜的展開方法有上行法,下行法,雙向展開法,徑向展開法等。①上行法:使展開劑由下向上爬.②下行法:使展開劑由上向下.該法可使用極性較弱的展開劑.③雙向展開法:取方形薄板像紙色譜一樣進(jìn)行雙向展開.④徑向展開法:可將吸附劑涂成圓形或扇形,在圓心部分加如展開劑,使薄層徑向展開.⑤多次展開:用展開劑對(duì)薄層展開一次.稱為單次展開.一次展開后,取出薄板,揮發(fā)出去展開劑后再行展開.⑥梯度展開:該法所用的展開劑在連續(xù)不斷的改變組成.一般可把一個(gè)裝有強(qiáng)極性展開劑的滴定管深入密閉的含弱極性的展開劑的層析槽中,槽中用電磁攪拌器把滴下的強(qiáng)極性展開劑混勻,此時(shí),展開劑的極性逐漸由弱變強(qiáng),使極性差別較大的多種組分混合物得以很好的分離.第13頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月4.3顯色展開后,如物質(zhì)有色,可明顯的在薄層上觀察到它們的位置.如無色,則要通過一定的方法顯色,定位,一邊確定斑點(diǎn)的位置及大小.4.4常用溶劑的極性常用溶劑的極性順序：石油醚〈環(huán)己烷/己烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水。在薄層色譜中,當(dāng)溶劑的極性太大時(shí).會(huì)使待分離物全部接近溶劑前沿,當(dāng)溶劑的極性太小時(shí),又會(huì)使待分離物幾乎全部保留在圓點(diǎn),這兩種情況都是待分離物得不到分離.使用單一溶劑，往往不能達(dá)到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低極性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethylacetate,Petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether,Petroleumether/CH2Cl2,CH2Cl2/ethylacetate,ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate第14頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月柱層析

極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸第15頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月1、稱量

200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2、攪成勻漿加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對(duì)酸敏感，不能用氯仿體系過柱。勻漿法第16頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月3、裝柱將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會(huì)有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4、壓實(shí)沉降完成后，加入更多的石油醚（氯仿），用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。第17頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5、上樣干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會(huì)沖壞硅膠表面。6、過柱和收集柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。第18頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月7、檢測(cè)要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會(huì)損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。8、送譜收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。第19頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月TIPS:1.先根據(jù)TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化2.將柱子必須裝平整、均勻3.考慮有限柱填料的吸附量4.可考慮用梯度法分開并洗脫第20頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動(dòng)速度，減少產(chǎn)品收集的時(shí)間，但是會(huì)減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時(shí)候，常壓柱是效率最高的，但是時(shí)間也最長(zhǎng)，比如天然化合物的分離，一個(gè)柱子幾個(gè)月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會(huì)使溶劑揮發(fā)（有時(shí)在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時(shí)使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時(shí)間長(zhǎng)）。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會(huì)減低分離效果。關(guān)于無水無氧柱，適用于對(duì)氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品。第21頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于柱子的尺寸柱子長(zhǎng)了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^?。@樣相對(duì)的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對(duì)于產(chǎn)品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的說，不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費(fèi)）。第22頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。第23頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于濕法、干法上樣濕法上樣，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會(huì)析出，這一般都是比較大量的樣品才會(huì)出現(xiàn)，是因?yàn)楣枘z對(duì)樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會(huì)發(fā)生，這就應(yīng)該先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動(dòng)會(huì)溶解的。干法上樣，一般用于固體或粘度大的液體樣品。樣品用低沸點(diǎn)易溶溶劑溶解，加入1-3倍的粗硅膠，晾干或旋干，干燥的標(biāo)準(zhǔn)是硅膠成細(xì)粉而不粘在瓶壁上。裝好的柱子上留一段溶劑，把吸附了樣品的硅膠慢慢到進(jìn)去，震動(dòng)柱子或再加一些溶劑，把粘在柱壁上的硅膠洗下。第24頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月溶劑的選擇當(dāng)然是最便宜，最安全，最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻(xiàn)中有寫用正己烷的，太貴了，除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還快，不過因?yàn)闃O性很小，有時(shí)還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別讓溶劑流干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅膠的吸附是一個(gè)放熱過程，所以夏天的時(shí)候經(jīng)常會(huì)在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時(shí)候會(huì)好一些。甲醇，據(jù)說能溶解部分的硅膠，所以產(chǎn)品如果想過元素分析的話要留神，應(yīng)該經(jīng)過后繼處理，比如說重結(jié)晶等。其他的溶劑用的相對(duì)較少，要依個(gè)人的不同需要選擇了。第25頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這里是用10升或25升的塑料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質(zhì)，其他的雜質(zhì)就可想而知了，所以在比較嚴(yán)格的柱分時(shí)就要對(duì)溶劑重蒸。當(dāng)然過原料時(shí)就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi)，缺點(diǎn)是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過柱同時(shí)進(jìn)行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會(huì)導(dǎo)致極性的變化，一般會(huì)使得極性變大，在梯度淋洗時(shí)比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子后，溶劑最后回收要采用常壓，因?yàn)樵跍p壓旋蒸時(shí)會(huì)有部分低沸點(diǎn)的雜質(zhì)一起出來，常壓時(shí)就會(huì)減少這種現(xiàn)象，如果雜質(zhì)和你下面要過的樣品有反應(yīng)那就慘了。第26頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于操作問題1裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤(rùn)滑劑，會(huì)被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門（T型四氟節(jié)門三通接頭）的。干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會(huì)從一側(cè)斜著下來）。書中寫的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數(shù)