6種不同極性溶劑提取物對6種常見菌的抑菌性篩選

6種不同極性溶劑提取物對6種常見菌的抑菌性篩選

裸花紫珍珠etarn是馬鞭草科的一種植物。在中國，它主要分布在廣東、廣東和海南。藥品的位置是地上的干燥部分。它是海南的大面積隧道醫(yī)療材料之一。裸花紫珠全年均可采收,除去雜質(zhì),曬干,枝葉有抗菌止血、消炎解毒、祛風(fēng)祛濕之功效1細(xì)菌培養(yǎng)算法裸花紫珠,海南九芝堂藥廠提供;白色念珠菌;銅綠假單胞菌;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌,肺炎雙球菌,枯草芽孢桿菌;臨床分離菌株,海南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室傳代保藏多次后的菌株。2方法和結(jié)果2.1菌株的活化培養(yǎng)準(zhǔn)確稱取生物樣品凍干品9g,裝入34ml萃取池中,萃取池底部提前加裝纖維素濾片,依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、水為提取溶劑,設(shè)定ASE提取參數(shù)(提取壓力為10MPa,提取溫度為45℃,提取時(shí)間12min,循環(huán)2次)白色念珠菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、銅綠假單胞菌分別接種于NB培養(yǎng)基中(18gNB粉末溶于1L蒸餾水中,分裝三角瓶,121℃高壓滅菌15min),37℃活化培養(yǎng)1次(第2次的時(shí)候,培養(yǎng)一批菌)每次活化培養(yǎng)時(shí)間為16h。然后接入至無菌NB培養(yǎng)基中,150r·min對6種菌分別吸取一定濃度的提取藥液100μl至放好的的牛津杯中,注意不要將藥液溢出牛津杯外,同時(shí)吸取相同體積的DMSO和頭孢他啶加入準(zhǔn)備好的牛津杯中。指示菌在最適生長溫度37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,記錄抑菌圈值。2.1.7反應(yīng)物的抑菌效果從表3的結(jié)果可以看出,不同的提取藥液有不同的抑菌效果,但水提藥液幾乎看不到抑菌圈,其他5種提取藥液對不同的菌分別有不同的抑菌效果。除了水提物,其他5種溶劑提取藥液對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌都有比較好的抑菌效果,其他4種菌在某一種到兩種溶劑提取液中有較好的抑菌效果,乙酸乙酯提取液對多數(shù)菌種有中強(qiáng)度的抑菌效果。頭孢對每一種菌都有非常好的抑菌圈值,DMSO沒有抑菌性或者說抑菌性很弱。2.2ase聯(lián)合有機(jī)溶劑提取法活細(xì)胞中的乳酸脫氫酶能將刃天青(藍(lán)色)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)試鹵靈(粉紅色),試鹵靈繼續(xù)被細(xì)胞還原為無熒光的白色物質(zhì)(白色),無活性或死亡的細(xì)胞喪失了代謝能力而不能還原刃天青準(zhǔn)確稱取50mg的刃天青試劑,使用無菌水溶解,定容到50ml的的容量瓶里,配制成1mg/ml溶液,5°C避光保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取裸花紫珠粉末10g,裝入34ml萃取池中,萃取池底部提前加裝纖維素濾片,依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇為提取溶劑,設(shè)定ASE提取參數(shù)(提取壓力為10MPa,提取溫度為45℃,提取時(shí)間12min,循環(huán)2次),有機(jī)溶劑提取液常溫干燥,分別制得裸花紫珠不同的生物活性物質(zhì)。稱取相同質(zhì)量0.2g活性物質(zhì)用2ml二甲基亞砜(DMSO)溶解成0.1g/ml,待用。使用純的DMSO完全溶解后,用一定濃度的DMSO進(jìn)行對半稀釋8個濃度。頭孢同樣使用無菌水配制成50mg/10mL溶液后。由于在做刃天青實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)DMSO在一定濃度下有抑菌作用,且對大腸桿菌作用較弱,所以,需做預(yù)實(shí)驗(yàn)消除DMSO對本實(shí)驗(yàn)的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)通過增加大腸桿菌菌懸液的體積來稀釋DMSO的濃度,達(dá)到確定加菌懸液和藥液的量的目的。從表4可以看出DMSO在11%以下顯示對大腸桿菌沒有抑菌性,所以在實(shí)驗(yàn)時(shí)必須把其調(diào)到更低才可以不影響實(shí)驗(yàn)。所以,又考慮到直接用提取溶劑做空白對照,再進(jìn)行溶劑測試預(yù)實(shí)驗(yàn)。2.2.4.加溶劑對實(shí)驗(yàn)的影響從表5可以看出只有乙醇和石油醚可能在加菌量至少為175μl以上及加溶劑為20μl時(shí)才不會影響實(shí)驗(yàn),此時(shí)溶劑體積濃度為10.2%。綜上,DMSO濃度要求稍弱些,所以,在96孔板中按照表6加樣。2.2.5懸浮液的制備每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,加樣后,用封口膜將96孔板密封并置于37°C自動新型恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h,每小時(shí)觀察1次顏色變化并記錄。2.2.7不同提取藥劑抑菌效果檢測從圖1可以看出第1排為,只加了菌和DMSO的陰性對照,全顯示紅色(黑白圖呈淺灰色),表明DMSO對實(shí)驗(yàn)菌沒有抑菌效果或者效果很弱,第2排為頭孢的陽性對照組,全顯藍(lán)色(黑白圖呈深色),說明頭孢有很好的抑菌效果,3~7為5種提取藥液對大腸桿菌的顯色結(jié)果,可以看出乙醇和正丁醇都有較低的抑菌顯色結(jié)果,乙酸乙酯和氯仿段沒有,石油醚段也有最低抑菌濃度,但比乙醇和正丁醇濃度高。8~12為5種提取藥液對枯草芽孢桿菌顯色結(jié)果,可以看出乙醇和正丁醇也都有較低的抑菌顯色結(jié)果,乙酸乙酯段抑菌效果較弱,氯仿段提取液幾乎沒有抑菌效果,石油醚段較高的抑菌濃度顯色結(jié)果。從表7可以看出乙醇和正丁醇段對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度相對都較小,平均值分別為0.022g·ml3討論中藥消毒劑中的主要活性成分有苯丙素類化合物、醌類化合物黃酮類化合物、疏類和揮發(fā)油、三萜及其苷類、生物堿類1.1材料表面1.2主試劑和設(shè)備見表1~表2。2.1.1萃取液體2.1.2懸浮液的制備2.1.3培養(yǎng)基的制備在無菌操作臺,將肉湯培養(yǎng)基加入瓊脂后,溶解均勻,在高壓蒸汽滅菌鍋中,用0.1MPa壓力滅菌20min,并冷卻至60℃左右,用移液槍準(zhǔn)確量取20ml該培養(yǎng)基,加入內(nèi)徑一致并預(yù)先水平放置的培養(yǎng)皿內(nèi),凝固后并使培養(yǎng)皿中水份干燥透,待用。2.1.4不同菌株對牛蒡杯的mic實(shí)驗(yàn)吸取一定濃度的指示菌菌懸液150μl至制好的平板上,用無菌耙涂布均勻,并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中,在水平放置的平皿中均勻地放置2只牛津杯,待放入相同藥液,作為平行實(shí)驗(yàn),共需要36個平板實(shí)驗(yàn),此外每種菌還需要2只DMSO空白對照,2只頭孢陽性對照,所以,再需要做12個平板實(shí)驗(yàn)。2.1.56種溶劑提取物溶液的添加