倍半稀釋法測定10-hda對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

倍半稀釋法測定10-hda對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

10-羥色胺-2-戈齊酸（10-hydro-2-acid），簡稱10-hda。這是人體中的重要脂肪酸。約50%的天然脂肪體在天然漿中含量約為1.4%2.0%。關(guān)于抗菌物質(zhì)的抑菌機(jī)理報(bào)道很多,一般認(rèn)為抑菌劑的主要作用途徑是膜攻擊、抑制細(xì)胞呼吸或者抑制蛋白質(zhì)的合成等1材料和方法1.1其他試劑的制備金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種,其他試劑均為分析純。DDS-11A電導(dǎo)率儀,上海第二分析儀器廠;紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;DYY-12電泳儀,北京市六一儀器廠;ChampGel5500凝膠成像系統(tǒng),北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;原子力顯微鏡,德國Bruker公司。1.2測試方法1.2.1菌種培養(yǎng)及培養(yǎng)配制LB液體培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20min后,冷卻,接種金黃色葡萄球菌后于37℃、180r/min條件下培養(yǎng)24h。取菌液進(jìn)行平板劃線培養(yǎng),挑取生長狀況較好的單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)培。1.2.2lfoxide,dmso液體倍半稀釋法:用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,即DMSO)配制10-HDA倍比稀釋液,同時(shí)設(shè)置無菌水對(duì)照組和溶劑對(duì)照組(即DMSO對(duì)照組)。取對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液稀釋至1×101.2.3-hda的體外生長取活化后的金黃色葡萄球菌菌種按1%(v/v)接種量分別接種于4個(gè)100mLLB培養(yǎng)基中,分別加入等體積的不同濃度的10-HDA,使其終濃度分別為0×MIC(即DMSO對(duì)照組)、1×MIC、3×MIC,同時(shí)設(shè)置無菌水空白對(duì)照組,于37℃、180r/min培養(yǎng),不同時(shí)間點(diǎn)取樣測OD1.2.4菌株4的離心測定將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌于5000r/min離心10min,收集菌體。然后用滅菌生理鹽水洗滌,重復(fù)操作兩次,然后用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度至101.2.5影響細(xì)菌物質(zhì)含碳量的體積在濃度為101.2.6影響細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)特征的影響取制備的濃度為101.2.7影響細(xì)菌代謝活力的因素取制備的濃度為101.2.8添加dmso后體外生長曲線金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,按5%(v/v)接種量分別接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中,分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,試驗(yàn)組加入10-HDA溶液分別使其終濃度為1×MIC、3×MIC,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,加入等體積的DMSO溶劑,繼續(xù)于37℃、150r/min培養(yǎng),分別于8h后取樣,稀釋成相同的吸光度值后取樣10mL于5000r/min離心10min。然后用生理鹽水洗滌2次,取沉淀加20μL無菌水和20μL上樣緩沖液于100℃保溫5min,再次離心,取10μL上清液進(jìn)行SDS凝膠電泳。2結(jié)果與分析2.1mic測試結(jié)果由表1結(jié)果可知,10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯,最小抑制質(zhì)量濃度為0.062mg/mL。2.2對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響菌液的光密度值(OD值)可以用來衡量菌液中細(xì)菌數(shù)目的多少,因此,OD值的變化可以間接的反應(yīng)10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響情況。10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌生長曲線的影響見圖1。由圖1結(jié)果可知,無菌水對(duì)照組和0×MIC試驗(yàn)組(即DMSO對(duì)照組)的菌體生長狀態(tài)幾乎無差別,因此可以忽略10-HDA的溶劑(DMSO)對(duì)金黃色葡萄球菌的生長的影響。加入10-HDA的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比,菌液的光密度值明顯降低,表明10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌的生長有較好的抑制作用,且隨著加入的10-HDA濃度由1×MIC增加到3×MIC,OD2.3對(duì)菌體膜滲透率的影響在正常情況下,細(xì)菌的細(xì)胞膜具有一定的半透性及流動(dòng)性。當(dāng)細(xì)菌不利生長條件或者抑菌劑作用時(shí),細(xì)菌細(xì)胞膜會(huì)遭到破壞,喪失其半透性并流動(dòng)性降低,進(jìn)而菌體的保護(hù)屏障被打破,內(nèi)部的電解質(zhì)(如K圖2反映了金黃色葡萄球菌經(jīng)10-HDA處理后其菌液電導(dǎo)率的變化情況。由圖2可知,無菌水對(duì)照組和0×MIC試驗(yàn)組(即為溶劑對(duì)照組)的菌液電導(dǎo)率變化不大,因此可以忽略溶劑二甲基亞砜對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜滲透性的影響。而當(dāng)菌液在1×MIC濃度的10-HDA處理后,菌液的電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組,這說明了在1×MIC濃度的10-HDA使細(xì)胞膜遭到破壞,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性降低,通透性增大,從而大量電解質(zhì)外滲。隨著作用時(shí)間的延續(xù),菌液的電導(dǎo)率也相應(yīng)增加,菌體電解質(zhì)的外泄程度進(jìn)一步提高,說明菌體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞膜穩(wěn)定性已受到破壞,金黃色葡萄球菌的生長受到抑制。3×MIC的10-HDA對(duì)菌體的作用效果更加明顯,進(jìn)一步說明了10-HDA濃度與其對(duì)菌體細(xì)胞的作用效果正相關(guān)。2.4操作膜不透過受膜過氧化細(xì)菌的細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障。當(dāng)菌體細(xì)胞通透性屏障受損或其核心受到破壞,使得在正常狀態(tài)下不能透過細(xì)胞膜的具有紫外吸收的大分子物質(zhì)(如DNA、RNA等)通過細(xì)胞膜泄漏到菌懸液中,進(jìn)而導(dǎo)致菌懸液在260nm處的吸光度值增大2.5對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)測量原子力顯微鏡(AFM)是目前研究生物醫(yī)學(xué)樣品和生物大分子的必要研究工具。將加入10-HDA的金黃色葡萄球菌菌懸液,以及空白對(duì)照組的金黃色葡萄球菌菌懸液在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5h后,用AFM觀察金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)。金黃色葡萄球菌的2D效果圖,分別如圖A-1,圖B-1所示,3D效果圖分別如圖A-2,圖B-2所示。從圖A-1空白對(duì)照組金黃色葡萄球菌的二維形態(tài)圖中可以看出,空白對(duì)照組的金黃色葡萄球菌菌體成近乎圓形,細(xì)胞大小均一,對(duì)其中一個(gè)細(xì)胞的大小進(jìn)行測量,其長度約為1.04μm;從圖A-2空白對(duì)照組的三維形態(tài)圖中可以看出,空白對(duì)照組的金黃色葡萄球菌細(xì)胞飽滿,表面光滑。從圖B-1和圖B-2中可以看出,10-HDA處理金黃色葡萄球菌5h之后,金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面有褶皺,菌體有凹陷,對(duì)其中一個(gè)細(xì)胞的大小進(jìn)行測量,長度約為0.87μm,細(xì)胞大小明顯縮小。試驗(yàn)結(jié)果說明,10-HDA能夠破壞金黃色葡萄球菌的正常形態(tài),使細(xì)胞大小縮小并且表面形成褶皺。其原因可能是由于細(xì)胞內(nèi)容物的大量外泄使得菌體細(xì)胞壁凹陷,形成褶皺。2.6活化氫離子檢測10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌代謝活力的影響結(jié)果見圖5?；罴?xì)胞在脫氫酶的作用下生成一種活化氫離子,該離子可以將氯化碘硝基四唑紫還原成穩(wěn)定的甲瓚,因此可以利用甲瓚生成的速率來推測細(xì)胞的代謝活力2.7電泳條帶的變化由圖6可知,正常金黃色葡萄球菌蛋白的SDS電泳譜帶與10-HDA作用下的金黃色葡萄球菌蛋白電泳條帶相比,呈現(xiàn)明顯差別。10-HDA作用后,蛋白電泳條帶明顯變淺,有些條帶甚至消失,抑制了部分蛋白的正常表達(dá)。并且,隨著10-HDA濃度的增大,蛋白電泳條帶的變化更加明顯。為精確10-HDA處理前后金黃色葡萄球菌蛋白含量的變化,我們采用蛋白分析軟件Gel-Proanalyzer對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白電泳圖譜中比較明顯的條帶進(jìn)行分析。分析結(jié)果如表2所示。從表2的蛋白含量分析結(jié)果來看,經(jīng)10-HDA作用后的金黃色葡萄球菌蛋白含量明顯降低,包括r7,r8,r11。此外,10-HDA使得金黃色葡萄球菌中r5條帶消失。說明,10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白表達(dá)有一定程度的影響。3對(duì)細(xì)菌的抑菌機(jī)理本文通過倍比稀釋法確定10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.062mg/mL,同時(shí),進(jìn)一步研究了10-HDA對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)