動物實驗設(shè)計與實施

動物實驗設(shè)計與實施南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心第一部分：動物實驗設(shè)計和實施的基本過程一、選擇研究題目1、廣義的選擇2、狹義的選擇3、政府法規(guī)需要正確選題應(yīng)遵守的幾個基本原則；1、科學(xué)性：是指選題應(yīng)建立在前人的科學(xué)理論和實驗基礎(chǔ)上，而不是毫無根據(jù)的胡思亂想。2、目的性：指選題應(yīng)具有明確的理論意義和實踐意義，要能解決具體問題。3、創(chuàng)造性：指選題應(yīng)具有自己獨到之處，或提出新規(guī)律、新見解、新技術(shù)、新方法，或是對舊有的規(guī)律、技術(shù)、方法有所修改、補充。4、可行性：是指選題應(yīng)切合研究者的學(xué)術(shù)水平、技術(shù)水平和實驗條件，還要結(jié)合研究者的工作基礎(chǔ)，使實驗?zāi)軌蝽樌麑嵤?。二、提出假說假說是預(yù)先假定的答案或解釋，亦既是實驗的預(yù)期結(jié)果。對于動物實驗研究來說，假說是十分必要的。假說是實驗研究設(shè)計的前提，如果沒有假說，實驗和觀察就失去目標(biāo)。假說關(guān)系著實驗研究的目的性、計劃性和預(yù)見性。對假說既應(yīng)努力加以驗證，又應(yīng)適時加以拋棄，重新建立新的假說，再加以驗證。這樣才有可能使正確的假說上升為結(jié)論、原理和學(xué)說。研究者開展動物實驗前，應(yīng)在熟悉有關(guān)實驗動物理論知識和動物實驗技能的基礎(chǔ)上，積極進(jìn)行邏輯思維，結(jié)合實際條件，提出創(chuàng)新性課題和大膽的假說。假說提出的一般過程：1、觀察和記錄所有相關(guān)的信息（包括研究者已開展的初步實驗結(jié)果）2、分析和歸類這些信息3、在這些信息的基礎(chǔ)上提出假說三、選擇研究材料主要是用于制作實驗需要的動物模型常規(guī)品種（系）特殊品種（系）：疾病模型動物、轉(zhuǎn)基因品系等高峰期特殊規(guī)格：F1、乳鼠等外購：外地、外國、非商業(yè)性單位等四、準(zhǔn)備研究方案1、示意性的實驗設(shè)計，包含了實驗過程中的各種處理2、對實驗操作過程的解說和測量方法的描述3、簡述可能對動物造成的不適4、應(yīng)用動物的例數(shù)和所用的統(tǒng)計學(xué)方法都應(yīng)當(dāng)加以說明5、簡述實驗準(zhǔn)備情況，包括準(zhǔn)備的方法、過程和分析的資料6、實驗中的一些實際情況：人員需求、實驗負(fù)責(zé)人姓名、所需經(jīng)費實驗方法的選定實驗方法按學(xué)科可分為生理學(xué)方法、生物化學(xué)方法、生物物理方法、免疫學(xué)方法等；按性質(zhì)可分為形態(tài)學(xué)方法、機能學(xué)方法按范圍可分為整體綜合方法和局部分析方法按水平分：整體水平、器官水平、細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平、分子水平和量子水平等。無論選用何種實驗方法，均應(yīng)保證以下幾點:可靠性：即切實可行，穩(wěn)定可靠，是大家公認(rèn)的方法，也即是經(jīng)典方法。優(yōu)越性：指實驗方法既具先進(jìn)的一面，又便于與其它實驗方法相互配合，故也稱先進(jìn)性和協(xié)同性。創(chuàng)造性：即實驗方法的創(chuàng)新和改良。例：外源基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞體內(nèi)移植研究測定方法：整體水平：測定體液的生理生化指標(biāo)細(xì)胞和亞細(xì)胞水平：光鏡和電鏡觀察RNA水平：原位雜交法測定mRNART-PCR法半定量測定RNA表達(dá)量Northern法定量測定。蛋白水平：免疫組化與生物體視學(xué)結(jié)合Western

blotting定量測定Elisa法測蛋白活性五、動物實驗前的條件準(zhǔn)備主要內(nèi)容：準(zhǔn)備好實驗儀器、藥品、試劑和實驗動物。實驗條件的準(zhǔn)備要求是盡可能使實驗手段和實驗方法標(biāo)準(zhǔn)化。實驗儀器必須校準(zhǔn)，必須事先熟悉儀器使用方法。a、還要和相關(guān)科室聯(lián)系，達(dá)到部分儀器共享使用的目的。同時注意某些學(xué)科不太常用的儀器設(shè)備是否存在，是否會影響實驗指標(biāo)的檢測；b、測定動物生理、生化、生物電和器官功能指標(biāo)的各種分析儀器和描記儀，如半導(dǎo)體測溫計、動物血壓表、多導(dǎo)生理記錄儀等設(shè)備。藥品的純度應(yīng)有明確要求，試劑的配制必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，尤其是麻醉劑的使用。器械準(zhǔn)備、實驗場所消毒與器具配套等也要落實，特殊器械是否準(zhǔn)備：如顯微外科或眼科手術(shù)器械。實驗動物的準(zhǔn)備購入或領(lǐng)取實驗動物前，應(yīng)進(jìn)行各項計劃的核實，檢查各項實驗前的準(zhǔn)備工作，如動物籠盒數(shù)量、飼養(yǎng)室衛(wèi)生及消毒情況。購入或領(lǐng)取實驗動物時，應(yīng)向供應(yīng)部門索取所用動物的遺傳背景和微生物控制質(zhì)量資料、以及動物品系、年齡、體重、胎次等資料。根據(jù)實驗觀察時間長短的需要，同時購入或領(lǐng)取相應(yīng)數(shù)量的飼料和墊料。若是從外地購入動物需長途運輸時，還應(yīng)考慮到途中各種因素對動物的影響，如運輸環(huán)境的溫度，濕度、飲食。尤其注意途中污染和窒息死亡以及應(yīng)激反應(yīng)等問題。應(yīng)隔離檢疫并提供3周左右的動物適應(yīng)期。若是購入或領(lǐng)取清潔級以上實驗動物，應(yīng)采用帶有空氣過濾膜的無菌運輸罐或帶有濾帽的籠盒運輸，嚴(yán)格檢查其密封狀況。術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前3天單籠飼養(yǎng)，術(shù)前8－24小時禁食、禁水。六、預(yù)實驗是在動物實驗前對正式實驗進(jìn)行初步實驗。目的在于檢查各項準(zhǔn)備

工作是否完善，實驗方法和步驟是否切實可行，測試指標(biāo)是否穩(wěn)定可靠，初步了解實驗結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的距離，從而為正式實驗提供補充、修正

的意見和經(jīng)驗，是動物實驗必不可少的重要環(huán)節(jié)。預(yù)實驗可用少量動物

進(jìn)行，實驗方法和觀測指標(biāo)應(yīng)該和正式實驗一樣，但預(yù)實驗的結(jié)果不能

歸入正式實驗的最后結(jié)果中一同分析。預(yù)實驗一樣要得到倫理委員會的審批才可實施。七、實驗的詳盡方案和實施1、需要準(zhǔn)備一個動物實驗的日程表，寫上簡單明了的實驗方案，實驗過程應(yīng)該描述清楚，注明對實驗動物品種、品系的選擇，動物的營養(yǎng)、飼喂方式和時間的選擇，樣本的采集和安樂死的方式。2、詳細(xì)的草案還應(yīng)該包括實驗者、實驗動物和實驗技術(shù)等幾個方面的問題。實驗技術(shù)如給藥途徑和方法、術(shù)式、麻醉方法和深度、復(fù)蘇和搶救措施等。3、實驗結(jié)束時收集所有的實驗資料，進(jìn)行各種后續(xù)指標(biāo)的檢測，包括運用數(shù)學(xué)統(tǒng)計的方法分析處理實驗數(shù)據(jù)。4、分析結(jié)果是否證明了原來的假設(shè)。實驗動物常用的采血方法尾尖采血：常用于大小鼠，小量采血?？梢远啻尾裳?。眼眶靜脈叢采血：常用于大小鼠、沙鼠的采血。摘眼球采血:血量較多，常用于大小鼠、沙鼠腹主動脈采血：常用于大小鼠、沙鼠，心臟采血：兔耳緣靜脈或耳中動脈、頸動脈采血犬：在前肢靜脈、后肢小隱靜脈采血猴：可在指尖、足跟、后肢皮下靜脈、頸靜脈采血豬：小型豬為耳大靜脈、后肢靜脈實驗動物各種采血方法的采血量一、小、大鼠1、剪尾采血此法每鼠可采10次以上。小鼠每次0.1ml。大鼠每次0.4ml。2、眼眶后靜脈叢采血小鼠每次0.2-0.3ml大鼠每次0.5ml2、股動脈采血小鼠每次0.5ml小鼠每次0.5ml二、豚鼠1.2.3.耳緣切口采血：0.5ml。心臟采血：足背正中靜脈采血：三、家兔1.2.3.耳緣靜脈采血：5-10ml。耳中動脈采血：15ml。心臟采血：20-25ml。四、犬1.2.3.前肢皮下頭靜脈和后肢外側(cè)小隱靜脈采血：10-20ml。頸靜脈采血：心臟采血：常用實驗動物的最大安全采血量與最小致死采血量動物種類最大安全采血量(mL)最小致死采血量(mL)小鼠0.10.3大鼠12豚鼠510家兔1040狗50300猴1560采集體液

胸水的采集

腹水的采集

消化液的采集尿液的采集

骨髓液的采集動物精液的采集乳汁的采集尿液的采集代謝籠法：此法較常用于大、小鼠：成熟小鼠尿量1-3ml/24h，大鼠為55-75ml/24h導(dǎo)尿法：常用于雄兔、犬等動物，要輕度麻醉，可以采到無污染的尿液。壓迫膀胱法：此法適用于兔、貓、犬等大動物。輸尿管插管法膀胱插管法膀胱穿刺法剖腹采尿法反射排尿法：適用于小鼠病理取材基本要求病理檢查應(yīng)分層次進(jìn)行，先進(jìn)行一般外觀觀察，然后剖檢觀察，再進(jìn)行光鏡詳細(xì)檢查。通常選擇正常與病變交界處組織，即包括病變本身及病變周圍組織。對照組動物相同器官取材時，選材部位應(yīng)盡量一致。肉眼看不到明顯病變時，各試驗組選取標(biāo)本位置應(yīng)一致。所選組織應(yīng)包括臟器全部層次結(jié)構(gòu)或重要結(jié)構(gòu)，如腎應(yīng)包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂。體積大和分葉的器官，應(yīng)視不同組織選取多個部位，小器官可整體取材并固定，如淋巴結(jié)、扁桃體、甲狀腺等。胃腸標(biāo)本應(yīng)將內(nèi)容物沖洗掉，以免內(nèi)容物影響組織的固定，產(chǎn)生自溶。所取材料應(yīng)盡量保持肉眼標(biāo)本的完整性，不宜過厚或過薄，一般厚約3-5mm，大小為1.5-2cm。切取組織時不要擠壓，使用鋒利刀具，少用剪刀，勿選用被器械鉗壓過的部位。標(biāo)本取材要熟練，盡可能快的完成整個過程，特別是易自溶的組織，如腸道、腦、腺體等。剖檢記錄應(yīng)客觀、詳細(xì)，用形象描述而不能用診斷的病名來代替。同一實驗中的對照組和實驗組動物應(yīng)交叉剖檢，嚴(yán)格統(tǒng)一各種條件和操作，盡量避免各種可能的干擾因素?！鞍菜佬g(shù)”的概念：即安樂死術(shù)，是指以人道的方法處死動物過程。在 處死動物的過程中盡量減少動物的驚慌、焦慮，使其安靜地、無痛苦地 死亡。安死術(shù)的常用方法頸椎脫位法：是將實驗動物的頸椎脫臼，脊髓與腦髓斷開，動物無痛苦死亡，大、小鼠最常用?？諝馑ㄈǎ禾幩劳?、貓、犬等較大動物常用此法，兔、貓為20-40ml，犬為80-150ml.放血法：一次性放出動物大量血液致使死亡，動物安靜，痛苦少，

臟器無損傷，采集病理切片很有利?？捎糜谛∈?、大鼠、兔、犬等。斷頭法：剪刀剪頭，大量失血死亡。臟器含血量少，適于采樣。藥物法：藥物吸入：吸入有毒氣體或揮發(fā)性麻醉劑。適用于小鼠、豚鼠等小動物。藥物有CO2、CO、乙醚、氯仿等。藥物注射：藥物注射致死，適用于豚鼠、兔、犬等較大動物。藥物有氯化鉀、巴比妥類麻醉劑等。采用安死術(shù)必須符合的標(biāo)準(zhǔn)死時無驚恐、疼痛表現(xiàn)。使其在最短時間內(nèi)失去意識迅速死亡。方法可靠且可重復(fù)。對操作人員安全。采用的方法要與研究要求和目的一致。對觀察者和操作者的情緒影響最小。對環(huán)境的影響最小。需要的機械設(shè)備簡單、價廉、易操作。處死動物地點應(yīng)遠(yuǎn)離并與動物房隔開。實驗動物常用的給藥方法和途徑一、經(jīng)口給藥自動口服給藥：灌胃給藥:二、注射給藥：皮下注射給藥皮內(nèi)注射肌肉注射給藥靜脈注射給藥腹腔注射給藥腦內(nèi)注射：椎管內(nèi)注射：關(guān)節(jié)內(nèi)注射：淋巴囊注射：蛙類常采用此法三、其他途徑給藥（吸入給藥等）人與實驗動物之間藥物劑量的換算1.人與實驗動物對同一藥物的耐受性，動物比人大，即單位體重的用藥量比人要大。2.一般可按下列比例換算，每單位體重人的藥量為1，則小鼠、大鼠為25-50，兔、豚鼠為15-20，狗、貓為5-10。常用藥物的最大給藥量動物項目灌胃皮下注射肌肉注射腹腔注射靜脈注射大鼠最大給藥量使用針頭2mL16號(鈍頭)lmL6號0.4mL6號2mL6號4mL5號小鼠最大給藥量使用針頭lmL9號(鈍頭)0.4mL5

l/2號0.4mL5

1/2號lmL5

1/2號0.8mL4號豚鼠最大給藥量使用針頭3mL16號(鈍頭)LmL6

1/2號0.5mL6

1/2號4mL7號5mL5號家兔最大給藥量使用針頭20mL10號導(dǎo)尿管2mL6

1/2號2mL6

1/2號5mL7號10mL6號麻醉方法：全身麻醉和局部麻醉，通常通過吸入和注射（靜脈、皮下、肌肉、腹腔）途徑。常用麻醉藥物：乙醚（吸入），戊巴比妥鈉、硫賁妥鈉、氯胺酮（靜脈），普魯卡因、利多卡因（局麻）常用麻醉藥的劑量及注射途徑種類戊巴比妥硫賁妥鈉鹽酸氯胺酮水合氯醛烏拉坦mg/kg途徑mg/kg途徑mg/kg途徑mg/kg途徑mg/kg小鼠3550IVIP2550I.V.IP22-44IM400IP--大鼠2550IVIP2040IVIP22-44IM300IP0.75IP豚鼠3040IVIP2055IVIP22-44IM200-300IP1.5IP家兔3040IVIP20IV22-441.0IVIP狗30IV25IV125IV1.0IV豬<45kg>45kg30-2015IVIV10-95IVIV10-1510-15IMIM麻醉注意事項麻醉前應(yīng)禁食8h以上麻醉前應(yīng)準(zhǔn)確稱體重注意麻醉劑量麻醉過程中注意觀察動物的反應(yīng)情況注意保溫靜脈注射時必須緩慢，在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應(yīng)加熱至動物體溫水平八、評估和報告1、標(biāo)題和實驗者：包括所有參與實驗研究的人員。2、摘要：簡要介紹實驗研究的目的、實驗設(shè)計、實驗方法和結(jié)論。3、導(dǎo)論：簡單地介紹相關(guān)的背景知識、國內(nèi)外類似研究現(xiàn)狀，提出可能的假設(shè)。如果假設(shè)不成立的話陳述一下預(yù)期的結(jié)果。4、材料和方法：5、實驗結(jié)果：通過圖形、表格和文字等將實驗結(jié)果展示出來，文字要簡介扼要。6、實驗結(jié)論：簡單扼要的得出實驗結(jié)論，說明假設(shè)被證明的情況和取得的科研成果，為將來的研究提出好的建議。7、致謝8、參考文獻(xiàn)實驗動物：遺傳背景、品種品系（近交系、封閉群或是其它特殊遺傳質(zhì)量控制）和正確的命名、模型的制作、動物的年齡、性別、體重、微生物控制等級等。動物實驗條件：實驗設(shè)施的類型、溫度、濕度、氣流、光照、籠具類型、飼養(yǎng)密度、墊料、運輸和喂養(yǎng)的時間等。營養(yǎng)：飼料（包括廠商、成分、配方、滅菌、質(zhì)量控制方案等）、采食情況（自由采食、限制飲食還是二者兼有）、飲水情況（自由飲水、自動化供應(yīng)、瓶裝、消毒、水質(zhì)）。實驗程序：化學(xué)物質(zhì)、藥品（劑量、廠商、純度、添加劑）、實驗持續(xù)時間、生理狀況、給藥途徑、樣本的采集、麻醉方法、安樂死方法、標(biāo)本的采集處理和組織器官的保存等。實驗設(shè)計：設(shè)計方法、評估方法和統(tǒng)計方法等。如果是在國外還應(yīng)該注明實驗動物管理委員會對實驗方案的審批情況。BALB/c（nu-nu）裸鼠20只，18-22g雌雄各半由南方醫(yī)科大學(xué)大學(xué)實驗動物中心提供動物質(zhì)量許可證：廣實動管第01號實驗鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，飼 喂全價小鼠顆粒飼料，自由采 食和飲水實驗方法：*****。實驗第7天，頸椎脫臼處死動物，***。動物名稱和遺傳背景動物數(shù)量和體重性別動物來源動物質(zhì)量資料實驗飼養(yǎng)條件安死術(shù)第二部分：動物實驗組織和管理概論使用實驗動物進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究計劃不是一個人能夠?qū)嵤┑?，是一個涉及很多人、復(fù)雜的研究過程。動物實驗研究需要各種人員進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆止?、配合。研究人員設(shè)計、組織和實施動物實驗和經(jīng)費管理，撰寫研究報告；有動物實驗資格的技術(shù)員按照實驗設(shè)計進(jìn)行具體的實驗操作；動物飼養(yǎng)員日常飼喂、管理； 實驗動物管理委員會檢查實驗中動物的福利是否得到保障、實驗方法是否人道等。一、關(guān)于動物實驗的法律、法規(guī)和相關(guān)要求1、動物實驗方案是否符合國家法律？在很多國家，不是所有關(guān)于動物實驗的方案都可以實施。2、所利用的動物實驗研究機構(gòu)是否是政府部門認(rèn)可的有權(quán)進(jìn)行動物實驗的機構(gòu)。3、研究人員進(jìn)行動物實驗設(shè)計和實施的資格。4、是否有充分的理由解釋使用動物進(jìn)行研究的必要性。5、是否有足夠的專業(yè)人員（飼養(yǎng)員、技術(shù)員等）來保證實驗順利進(jìn)行。6、實驗動物的來源是否合法，是否符合實驗動物的各種標(biāo)準(zhǔn)化控制條件。7、是否與當(dāng)?shù)氐膭游锔＠麢C構(gòu)有了溝通。8、研究計劃的進(jìn)行是否得到實驗管理委員會的批準(zhǔn)。9、是否有完整的實驗記錄。實驗動物管理委員會（IACUC）實驗動物福利和倫理管理委員會二、動物實驗的影響因素的控制要盡可能滿足下列條件，使實驗和動物的變異降到最小。一、動物因素種屬、品種、品系、年齡、體重及性別、生理狀態(tài)、健康狀況二、環(huán)境因素溫、濕度、氣流、潔凈度、光照、噪聲、營養(yǎng)、飼喂、環(huán)境微生物三、技術(shù)因素實驗季節(jié)、晝夜過程、麻醉深度、手術(shù)技巧、用藥途徑和方法等三、相關(guān)規(guī)范、規(guī)程和認(rèn)證優(yōu)良實驗室操作規(guī)范GLP（Good

Laboratory

Practice,

GLP)是國際上通

用的具有良好的質(zhì)量管理規(guī)范的簡稱，是藥品安全性評價過程中就組織管理、項目實施、記錄報告、資料保存等方面所制定的法規(guī)，其目的在于保證藥品

安全性評價的完整性、可靠性和重復(fù)性。盡管GLP最初目標(biāo)是為了保證動物

實驗在藥物毒性研究中的準(zhǔn)確性，將GLP規(guī)則推廣到其它涉及動物實驗的研

究領(lǐng)域中，有利于這些研究項目的標(biāo)準(zhǔn)化，增加實驗結(jié)果的重復(fù)性。當(dāng)然，

GLP規(guī)則并不能適合所有的動物實驗研究，因為每一類型的動物實驗對于標(biāo)

準(zhǔn)化都有其自身特殊的意義。藥物安全性評價實驗包括：單次給藥毒性試驗、反復(fù)給藥毒性試驗、生殖毒性試驗、遺傳毒性試驗、致癌試驗、局部毒性試驗、免疫原性試驗、安全性藥理試驗、依賴性試驗、毒代動學(xué)試驗等。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP（Standard

Operating

Procedure,SOP）:為有效地實施和完成某一試驗研究中每項工作所擬定的標(biāo)準(zhǔn)和詳細(xì)的書面規(guī)程。針對動物實驗研究主要的SOP規(guī)范有：對動物飼養(yǎng)、衛(wèi)生、實驗技術(shù)、觀測方法、動物檢查、數(shù)據(jù)收集和處理等都要有標(biāo)準(zhǔn)的SOP操作規(guī)程。動物分組與識別的SOP、飼養(yǎng)管理SOP、觀察記錄及實驗操作的SOP、動物尸檢以及組織病理學(xué)檢查處理的SOP、動物尸體及其他廢棄物處理的SOP、實驗標(biāo)本的采集、編號和檢驗的SOP、數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理的SOP、資料檔案管理SOP等AAALAC認(rèn)證實驗動物管理評估和認(rèn)證協(xié)會（Association

forAssessment

and

Accreditation

of

LaboratoryAnimal

Care,AAALAC）:非贏利的私人組織，權(quán)威的評估和認(rèn)證動物飼養(yǎng)和使用標(biāo)準(zhǔn)的國際機構(gòu)，它要求人道、科學(xué)地對待動物。FDA和歐盟強力推薦在有AAALAC認(rèn)證的實驗室開展的動物實驗。世界500強醫(yī)藥巨頭聯(lián)合申明，他們醫(yī)藥產(chǎn)品的動物實驗都將在AAALAC認(rèn)證單位完成。AAALAC認(rèn)證在世界范圍內(nèi)享有很高的聲譽，為實驗動物領(lǐng)域樹立了高標(biāo)準(zhǔn)的楷模。（目前世界上已有29個國家的770多個機構(gòu)通過了AAALAC認(rèn)證。中國有12個機構(gòu)通過了AAALAC認(rèn)證，廣東地區(qū)廣州醫(yī)工院通過Beagle犬認(rèn)證）廣西食蟹猴實驗動物研發(fā)基地廣西：南寧國家高新區(qū)投資建成了“廣西南寧國際靈長類動物模型與醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化示范基地”，是國內(nèi)第一家通過國際資質(zhì)認(rèn)證的靈長類實驗動物室四、動物實驗集中化實驗動物供應(yīng)室：進(jìn)行實驗動物生產(chǎn)、采購、飼養(yǎng)、檢疫。實驗動物旅館：除了第一類服務(wù)范圍外，還可以安置、喂養(yǎng)不常用動物或需要特殊安置的動物。如羊、犬、靈長類等。但是如果進(jìn)行外科手術(shù)、X射線、胃鏡等檢測時還需要更換地方進(jìn)行相關(guān)項目檢查。動物實驗中心；是動物實驗集中化的最高形式，基本可以滿足一站式服務(wù)。我校的動物實驗設(shè)施南方醫(yī)科大學(xué)東莞松山湖實驗動物科技園東莞松山湖科技產(chǎn)業(yè)園區(qū)Dongguan

Songshan

Lake

Sci.Lake五、實驗的時間安排1、必須留出足夠的時間購買動物。2、必須留出必要的檢疫期。3、充分估計到動物不可預(yù)料的死亡或是自然死亡可能給實驗帶來的影響。4、必須留出足夠的時間來學(xué)習(xí)和掌握新的技術(shù)。5、必須留出足夠的時間來準(zhǔn)備特殊的動物飼料。6、進(jìn)行必要的預(yù)實驗。7、得到管理部門的許可。8、落實動物實驗所需的后勤資源保障：如動物房、飼養(yǎng)人員、實驗操作技術(shù)人員、試劑購買、所需配備的特殊設(shè)備（層流架、隔離器等）六、與他人協(xié)作研究組人員要保持溝通，及時總結(jié)經(jīng)驗，對下一步工作進(jìn)行預(yù)計。出現(xiàn)問題后商量如何調(diào)整實驗進(jìn)程等等。要保證有一個和諧的研究團(tuán)體，強調(diào)各個環(huán)節(jié)的協(xié)作性。西藏小型豬器官移植和轉(zhuǎn)基因克隆研究七、動物實驗的安全性1、正視實驗動物飼養(yǎng)和實驗環(huán)境對動物的影響，嚴(yán)格控制各種影響實驗結(jié)果的動物疾病，尤其是動物傳染病，如小鼠仙臺病毒、兔腦炎病毒等。2、嚴(yán)格控制各類人獸共患病的發(fā)生，尤其是使用野生動物（如靈長類動物）時，由于高等級動物和人類的親緣性更近，其疾病的易感性更強，要特別注意安全保護(hù)。如出血熱、狂犬病、傳染性肝炎、猴皰疹病毒、布魯氏菌病等。3、感染動物實驗：專門的感染動物實驗設(shè)施，如P3實驗室（生物安全防護(hù)3級實驗室）。實驗動物病原分類A:人畜共患病B:實驗動物致死病原C:非致死但可引起實驗動物發(fā)生疾病或生理功能改變D:條件致病菌E:非病原但可為反映實驗動物微生物控制的指標(biāo)等級微生物種類小鼠

大鼠ABCDE漢他病毒（Hantavirus）淋巴球性膜絡(luò)腦膜腦炎病毒（Lymphocytic

choriomeningitisvirus，LCMV）沙門式桿菌（Salmonella

spp.）白癬菌（Dermatophytes）仙臺病毒（Sendai

virus）鼠痘病毒（Ectromelia

virus）小鼠肝炎病毒（Mouse

hepatitis

virus，MHV）肺炎黴漿菌（Mycoplasm

pulmonis）纖毛桿菌（Cilia-associated

respiratory

bacillus,CAR）腸黏膜肥厚癥菌（E.

coli

O-115

a,c:k(b)）肺曩原蟲（Pneumocystis

carinii）唾液腺淚腺病毒（Sialodacryoadenitis

virus，SDAV）小鼠肺炎病毒（Pneumonia

virus

of

mice，PVM）小鼠腦脊髓炎病毒（Mouse

encephalomyelitis

virus，GD-7）克氏大鼠病毒（Kilham

rat

virus，KRV）H-1

大鼠病毒（H-1

virus）小鼠微小病毒（Minute

virus

of

mice，MVM）小鼠腺病毒（Mouse

adenovirus，Mad）梭狀桿菌/Tyzzer

病（Clostridum

pilifrome）庫氏棒狀桿菌（Corynebacterium

kutscheri）肺炎巴斯德桿菌（Pasteurella

pneumotropica）支氣管敗血癥菌/博得氏桿菌（Bordetella

bronchiseptica）肺炎鏈球菌（Streptococcus

pneumoniae）肝型螺旋桿菌（Helicobacter

hepaticus）小鼠梨型原蟲（Giardia

muris）六鞭毛蟲（Spironucleus

muris）綠膿桿菌（Pseudomonas

aeruginosa）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus

aureus）鼠盲腸蟯蟲（Syphacia

spp.）鼠大腸蟯蟲（Aspiculuris

tetraptera）○○○

○○

○○

○○○○

○○

○○○

○○○

○○

○○○○

○○

○○

○○

○○

○○○○○

○○

○○

○○

○○

○○

○第三部分：動物實驗設(shè)計一、動物實驗設(shè)計的概念二、動物實驗設(shè)計“三要素”1、實驗對象(subject)2、實驗因素(treatment

factor)3、實驗效應(yīng)(experimental

effect)高血壓大鼠血壓值處理因素降壓藥受試對象實驗效應(yīng)其他因素其他效應(yīng)

實驗對象。實驗所用的材料即為實驗對象,或稱為受試對象。實驗對象選擇的合適與否直接關(guān)系到實驗實施的難度，以及別人對實驗新穎性和創(chuàng)新性的評價。一個完整的實驗設(shè)計中所需實驗材料的總數(shù)稱為樣本含量。 實驗因素。所有影響實驗結(jié)果的條件都稱為影響因素，實驗研究的目的不同，對實驗的要求也不同。影響因素有客觀與主觀，主要與次要因素之分。處理因素或受試因素：根據(jù)研究目確定的欲施加或欲觀察的、并能引起受試對象直接或間接效應(yīng)的因素，簡稱處理或因素(factor)。是根據(jù)研究目的確定的主要因素，處理因素在整個實驗中應(yīng)始終要保持不變非處理因素：對評價處理因素作用有一定干擾，但研究者并不想通過實驗考察其作用大小的因素，常常又稱混雜因素(confounder)。確定處理因素時要注意的幾個問題：要抓住實驗中的主要因素。要在眾多的因素與水平中抓住主要的、帶關(guān)鍵性的某幾個因素。例：病毒培養(yǎng)方法改進(jìn)實驗要根據(jù)實驗?zāi)康拇_定處理因素和非處理因素，一旦確定就不能隨意改動。例：冷水浸泡實驗處理因素必須標(biāo)準(zhǔn)化：保證處理因素在整個實驗的過程中始終如一，保持不變。3）實驗效應(yīng)。實驗因素取不同水平時在實驗單位上所產(chǎn)生的反應(yīng)稱為實驗效應(yīng)。實驗效應(yīng)是反映實驗因素作用強弱的標(biāo)志，它必須通過具體的指標(biāo)來體現(xiàn)。所選定的指標(biāo)，應(yīng)符合下列基本條件：特異性：指標(biāo)應(yīng)特地反映所觀察事物的本質(zhì)，即能特異地反映某一特定現(xiàn)象，不致與其它現(xiàn)象相混淆?？陀^性：最好選用可用具體數(shù)值或圖形表達(dá)的指標(biāo)（如心電圖、化驗檢查等），客觀指標(biāo)是測量和檢驗的結(jié)果，是借助儀器來回答的；而主觀指標(biāo)（如一些定性指標(biāo)）是實驗者自己判斷的，易受主觀因素的影響而造成較大誤差。重復(fù)性：重復(fù)性高的指標(biāo)一般表示無偏性或偏性小、誤差小，能較真實的反映實際情況。不選用重現(xiàn)性小的指標(biāo)。靈敏性；指標(biāo)測量的技術(shù)方法或儀器靈敏度十分重要。該測出的變化測不出，就會得出“假陰性結(jié)果”，儀器不精密，所得陽性數(shù)值則不真實。技術(shù)和設(shè)備的可能性：盡量選用既靈敏客觀，又切合本單位和研究技術(shù)和設(shè)備實際的指標(biāo)。指標(biāo)選定必須有根據(jù)；現(xiàn)成（定型）指標(biāo)必須有文獻(xiàn)依據(jù)，自己創(chuàng)立的指標(biāo)必須經(jīng)過專門鑒定。對一些半客觀（比如讀pH試紙上的數(shù)值）或主觀指標(biāo)的判斷上，一定要事先規(guī)定讀取數(shù)值的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，只有這樣才能準(zhǔn)確地分析自己的實驗結(jié)果，從而也大大提高了自己實驗結(jié)果的可信度。例：慢性酒精性肝損傷動物實驗研究：過氧化脂質(zhì)反應(yīng)的相關(guān)檢測：超氧化物歧化酶SOD丙二醛MDA還原型和氧化型谷胱甘肽(GSH)脂質(zhì)過氧化物L(fēng)PO甘油三酯TG肝功能指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶其它可選指標(biāo)：琥珀酸脫氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等酶系活性；總蛋白、總膽固醇等血清生化指標(biāo)；IL-8、TNF等炎性因子。三、動物實驗設(shè)計的基本原則實驗研究主要是通過對樣本的研究而得出結(jié)論。要將樣本的結(jié)論外推到總體，必須盡量使樣本能夠真實地代表總體。但是，實驗動物的種系和個體差異、實驗環(huán)境差異、儀器的穩(wěn)定性、藥品的純度、樣本的大小等因素都可能產(chǎn)生實驗誤差，影響樣本結(jié)果的代表性。為避免或縮小誤差，實驗設(shè)計時必須注意誤差控制。為此，動物實驗設(shè)計應(yīng)遵循如下原則：對照的原則隨機化原則重復(fù)的原則一致性原則彈性原則最經(jīng)濟原則1、對照(control)：對照的意義在于它可以使處理因素和非處理因素的差異有一個科學(xué)的對比。對照組與實驗組的非處理因素相同，非處理因素的影響得到抵消，使處理因素的效應(yīng)得以顯露。處理組對照組處理因素+非處理因素(無)

非處理因素處理效應(yīng)+非處理效應(yīng)(無)

非處理效應(yīng)比較結(jié)果

處理因素

處理效應(yīng)排除“非處理因素”的影響，從而襯托出“處理因素”的作用。對照組設(shè)置的要求： 對等：除處理因素外，對照組具備與實驗組對等的一切非處理因素，具有高度的可比性。同步：對照組與實驗組設(shè)立之后，在整個研究進(jìn)程中始終處于同一空間和同一時間。專設(shè)：任何一個對照組都是為相應(yīng)的實驗組專門設(shè)立的。不得借用文獻(xiàn)上的記載或以往的結(jié)果或其它研究的資料作為本研究之對照。對照的種類：1、組間對照空白對照安慰劑對照實驗條件對照標(biāo)準(zhǔn)對照2、自身對照空白對照對照組不施加任何處理因素。特點：簡單易行，但容易引起心理差異，從而影響實驗效應(yīng)的測定。只有在處理因素很強，非處理因素很弱的情況下使用。安慰劑對照安慰劑：無藥理作用，其外觀如劑型、大小、顏色、重量、氣味及口味等與試驗藥物一致,不為受試動物所識別。例如：以安慰劑為對照，研究使用艾拉莫德片對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果。目的：克服研究者、受試對象、評價者等由于心理因素所形成的偏倚；還可消除疾病自然進(jìn)程的影響。實驗條件對照對照組不施加處理因素，但施加某種與處理因素相同的實驗條件。包括操作技術(shù)、被試因素溶媒或其他載體等。凡對實驗效應(yīng)產(chǎn)生影響的實驗條件宜采用此法。例如：觀察賴氨酸對幼年動物發(fā)育的影響，實驗組動物飼喂含賴氨酸的顆粒飼料，對照組動物飼喂不含賴氨酸的顆粒飼料。含賴氨酸顆粒飼料+非處理因素→賴氨酸效應(yīng)

+顆粒飼料效應(yīng)+非處理因素效應(yīng)顆粒飼料+非處理因素→

顆粒飼料效應(yīng)+非處理因素效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對照對照：用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法或常規(guī)方法作對照，如藥理學(xué)研究中，用已知的有效藥物、有效療法或公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)療法作對照。在實驗室研究中常用于某種新檢驗方法是否能代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法的研究。自身對照在同一個體身上觀察實驗處理前后某種指標(biāo)的變化，即把實驗處理前的觀察指標(biāo)作為實驗處理后同一指標(biāo)變化的對照，可有效減少個體差異對實驗處理反應(yīng)的影響。例如：機體對稱部位自身對照：研究某治療燒傷新藥的療效，就可選用有對稱部位被燒傷

(如雙前肢或雙后肢等)的受試對象，一部位用燒傷新藥，另一部位用其它公認(rèn)有效藥物2、隨機化(randomization)：除了處理因素外，其它所有可能產(chǎn)生混雜效應(yīng)的非處理因素在各組中（對照和實驗組）盡可能保持一致，保證和提高各組的均衡性，也是資料統(tǒng)計分析時進(jìn)行統(tǒng)計推斷的前

提。機會均等抽樣隨機每一個符合條件的實驗對象參加實驗的機會相同，即總體中每個個體有相同的機會被抽到樣本中來；保證樣本的代表性。分組隨機每個實驗對象分配到不同處理組的機會相同，保證其他因素在對比組間的均衡性實驗順序隨機每個實驗對象接受處理先后的機會相同；使實驗順序的影響也達(dá)到均衡。隨機化的方法抽簽或擲硬幣隨機數(shù)(randomnumber)：隨機數(shù)字表和計算機(或計算器)的偽隨機數(shù)發(fā)生器。實驗設(shè)計中常用的兩種隨機化方法：完全隨機化和分層隨機化完全隨機化(complete

randomization)直接對受試對象進(jìn)行隨機化分組編號：將n個受試對象編號，動物可按體重大小。 取隨機數(shù)：可從隨機數(shù)字表或計算器或計算機獲得。每個受試對象獲得的隨機數(shù)可是一位數(shù)，也可是兩位數(shù)或三位數(shù)，一般要求與n的位數(shù)相同。 確定組別：根據(jù)受試對象獲得的隨機數(shù)決定受試對象在哪一組。分兩組可按隨機數(shù)的奇偶；分k組可按隨機數(shù)除以k后的余數(shù)進(jìn)行分組。例：試將同性別、體重相近的15只動物分到A、B、C三組(1)(2)(3)(4)(5)88565327591B2C2C0A2C(6)(7)(8)(9)(10)33357267470A2C0A1B2C(11)(12)(13)(14)(15)773455457021101CBBAB

先對可能影響實驗過程和結(jié)果的混雜因素進(jìn)行分層，然后在每一層內(nèi)進(jìn)行完全隨機化。配對隨機化(paired

randomization)和區(qū)組隨機化(blockrandomization)可看成是分層隨機化的實際應(yīng)用?；静襟E：分層編號排序：將每層的受試對象編號排序，如體重從輕到重，時間由前至后等。取隨機數(shù)：同樣可從隨機數(shù)字表或計算器或計算機獲得。確定組別：根據(jù)每層受試對象獲得的隨機數(shù)的大小順序決定受試對象在哪一組。分層隨機化(stratified

randomization)例:為比較四種抗癌藥物(A,B,C,D)的療效，將小鼠體重作為分層或區(qū)組因素，試分配處理。表8-2小白鼠區(qū)組隨機化的結(jié)果分隨機數(shù)隨機數(shù)序號隨機排列結(jié)果層鼠1鼠2

鼠3鼠4鼠1

鼠2

鼠3

鼠4鼠1鼠2

鼠3鼠418146

77614

1

3

2DA

CB20839

74002

3

4

1BC

DA39924

72484

1

3

2DA

CB………

………

…

…

………

……b3372

15992

3

1

4BC

AD3、重復(fù)(repetition)：是消除非處理因素影響的又一重要手段，重復(fù)的目的是使均數(shù)逼真，并穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)差，這樣才使統(tǒng)計量（樣本指標(biāo)）代表參數(shù)（總體指標(biāo)），統(tǒng)計推斷才具有可靠的前提。重復(fù)程度表現(xiàn)為樣本含量的大小和重復(fù)次數(shù)的多少?？煽啃哉麄€實驗的重復(fù):確保實驗的重現(xiàn)性，以提高實驗的可靠性；用多個受試對象進(jìn)行重復(fù)：避免把個別情況誤認(rèn)為普遍情況，把偶然性或巧合的現(xiàn)象當(dāng)作必然的規(guī)律，通過一定數(shù)量的重復(fù)，使結(jié)論可信；同一受試對象的重復(fù)觀察:保證觀察結(jié)果的精度。例如，血壓一般都測3次，以3次的均數(shù)作為最終結(jié)果。重復(fù)例數(shù)的決定因素：實驗處理效果的明顯性實驗誤差的大小動物個體變異的大小資料性質(zhì)第一類誤差α第二類誤差β實驗設(shè)計的類型樣本含量估計的意義過小，所得指標(biāo)不穩(wěn)定，用以推斷總體的精密度和準(zhǔn) 確度差；檢驗的功效低，應(yīng)有的差別不能顯示出來， 難以獲得正確的研究結(jié)果，結(jié)論也缺乏充分的依據(jù)。過大，會增加實際工作的困難，浪費人力、物力和時 間。重復(fù)例數(shù)的計算方法：1、一般估測法小動物(大鼠、小鼠、蛙、魚)：每組10-30例,計量資料每組不少于10例,計數(shù)資料每組不少于30例；中等動物(豚鼠、家兔)每組8-20例,計量資料每組不少于8例,計數(shù)資料每組不少于20例；大動物(犬、貓、豬、羊等)每組6-20例,計量資料每組不少于6例,計數(shù)資料每組不少于20例.2、假設(shè)檢驗時通過公式計算或查表：需明確如下指標(biāo)：①所比較的兩個總體參數(shù)間的差值，若無法得到參數(shù)的信息，可作預(yù)實驗或?qū)I(yè)上公認(rèn)的差值代替；②總體標(biāo)準(zhǔn)差，常用預(yù)試的樣本標(biāo)準(zhǔn)差來估計；③第一類誤差的概率(α)，既檢驗水準(zhǔn)；④檢驗效能1－β公式：n=2б2(tα+tβ)2/δ2n為樣本含量，б為標(biāo)準(zhǔn)差；tα取有顯著性的t分布值，t0.05=1.96；tβ為無顯著性的t分布值，1-β為實驗檢驗?zāi)芰Γ瑒游飳嶒炓话闳?-β=0.80，t0.20=0.842；δ為處理組與對照組均值間的差異，可從預(yù)實驗或文獻(xiàn)資料庫中獲得。有些實驗單做一種動物還不夠，應(yīng)當(dāng)重復(fù)做幾種動物。這不僅可以比較不同動物的差別，而且可以在不同動物實驗中發(fā)現(xiàn)新問題，提供新的線索。如動脈粥樣硬化的實驗，不同動物在血管的結(jié)構(gòu)、病變、α-和β-脂蛋白的比例以及膽固醇的水平各有不同，這樣不僅可以比較一些不同動物病理變化，也可以根據(jù)這些不同的變化尋找生化指標(biāo)與病變形成的關(guān)系，把實際工作推進(jìn)一步。由于不同種屬動物有不同的功能和代謝特點，所以在肯定一個實驗結(jié)果時最好采用兩種以上的動物進(jìn)行比較觀察，其中一種應(yīng)該是非嚙齒類動物。尤其是動物實驗結(jié)果要外推到人的實驗，所選用的動物品種應(yīng)不少于3種，而且其中之一不應(yīng)是嚙齒類動物。常用的生物序列是小鼠——大鼠——犬（小型豬或猴）。小鼠大鼠犬猴小型豬4、一致性原則：一個實驗設(shè)計方案的均衡性好壞，關(guān)系到實驗研究的成敗。應(yīng)充分發(fā)揮具有各種知識結(jié)構(gòu)和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高實驗設(shè)計方案的均衡性。要求實驗組和對照組除了處理因素不同之外，實驗對象、實驗條件、實驗環(huán)境、實驗時間、藥品、儀器、設(shè)備、操作人員等等，均應(yīng)力求一致。即：①

動物：品系、體重、年齡、性別、飼料和飼養(yǎng)方式等方面一致②

環(huán)境：實驗室溫度、氣壓、濕度、季節(jié)和時間等環(huán)境條件一致③

儀器：種類、型號、靈敏度、精確度、零點漂移、電壓穩(wěn)定性、操作步驟和熟練程度等方面一致④

藥物：廠商、批號、純度、劑型、劑量、注射容量和速度、酸堿度、溫度、給藥途徑和給藥順序等方面保持一致。5、彈性原則：即所謂空缺原則，指的是在時間分配上留有空缺。適當(dāng)?shù)目杖笔欠浅１匾模挥羞@樣才能富有彈性的實施實驗計劃，并不斷地調(diào)整好自己的實驗進(jìn)度。6、最經(jīng)濟原則：不論什么實驗，都有它的最優(yōu)選擇方案，這包括在資金的使用上，也包括人力時間的損耗上，必要時可以預(yù)測一下自己實驗的產(chǎn)出和投入的比值，這個比值越大越好，當(dāng)然是以你所擁有的實驗條件為基礎(chǔ)。四、常用動物實驗設(shè)計方法簡介1、單組比較設(shè)計：是指在同一個體上觀察處理前后某種觀測指標(biāo)的變化。又稱為自身對照設(shè)計。如果施與每個受試對象的處理是相互交叉的，又

稱為交叉設(shè)計。自身對照有3種形式：①

對每個觀察單位進(jìn)行兩次觀察，第一次觀察不給處理，第二次觀察給予處理，兩次結(jié)果的差值作為實驗效應(yīng)② 對每個觀察單位進(jìn)行兩次觀察，第一次是處理A，第二次是處理B，也以兩次結(jié)果的差值作為實驗效應(yīng)③

將受試對象隨機分為兩組，首先第一組給予處理A，第二組給予處理B，之后再換成第一組給予處理B，第二組給予處理A。兩組A處理的結(jié)果作為A的效應(yīng)，兩組B處理的結(jié)果作為B的效應(yīng)，A與B進(jìn)行比較，即交叉分組比較。此法的優(yōu)點是能清除個體間生物差異，但不適用于在同一個體上多次進(jìn)行實驗和觀察。還應(yīng)注意有時陰性對照前后兩次測量時一些指標(biāo)也經(jīng)常出現(xiàn)一定的差異（如體重、血壓等），此時要注意環(huán)境因素的控制。2、配對比較設(shè)計：指實驗前將動物按性別、體重或其它有關(guān)因素加以配對，以基本相同的兩個動物為一對，配成若干對，然后將一對動物隨機分配于兩組中。兩組動物的數(shù)量、體重、性別等情況基本相同，取得均衡后進(jìn)行實驗，以減少誤差及動物間的個體差異。動物實驗中：常將種屬、性別相同，年齡、體重相近的兩個動物配成對子。適用于總體同質(zhì)性差，對間同質(zhì)性不高，對內(nèi)同質(zhì)性較好。優(yōu)點：減少兩組實驗誤差及動物間的個體差異。抽樣誤差較小、實驗效率較高、所需樣本含量也較小缺點：應(yīng)考慮種屬、品系、性別、年齡與體重、同父母、同胎次出生等因素對實驗結(jié)果的影響。當(dāng)配對條件未能嚴(yán)格控制造成配對失敗或配對欠佳時，反而會降低效率。例：為研究VitE缺乏飼料對大鼠肝臟中VitA含量(u/mg)的影響，選取同性別(雌、雄各半)、同月齡(斷乳1個月)、同體重(50g+2g)等正常大鼠配成10對，對每對中每只大鼠按隨機數(shù)字表(或抽簽)隨機分配到給以正常飼料組和VitE缺乏飼料組，分飼條件相同的不同籠中，經(jīng)1個月飼養(yǎng)后處死，按每對分別取肝臟，測得VitA含量(u/mg)如表。

大鼠對別正常飼料組VitE缺乏組13.952.6523.803.3533.452.4543.352.6553.702.6563.903.1573.802.9083.051.9093.651.70102.002.503、完全隨機設(shè)計；亦稱單因素設(shè)計，是將每個實驗對象隨機分配在各組，并從各組實驗結(jié)果的比較中得出結(jié)論。通常用隨機數(shù)字表法進(jìn)行分組。各組樣本含量相等：平衡設(shè)計各組樣本含量不等：非平衡設(shè)計優(yōu)點：是設(shè)計和統(tǒng)計的處理都比較簡單，即使各處理組例數(shù)不等也不影響試驗結(jié)果的分析，抗數(shù)據(jù)缺失能力較強。但在例數(shù)較少時往往不能保證組間的一致性。缺點：只能分析一個因素，效率不高。對非實驗因素缺乏有效控制，適用于實

驗對象同質(zhì)性較好的實驗設(shè)計。小樣本時，可能均衡性較差，抽樣誤差較大。對個體間同質(zhì)性要求較高，在個體同質(zhì)性較差時，完全隨機設(shè)計并不是最佳設(shè)計。例：為比較小鼠接種3種不同菌型傷寒桿菌(9D、11C、DSC1)后存活 日數(shù)的差異，選擇同品系、性別(雌、雄各半)、體重(土1s)、月齡(土 2天)、生理精神狀態(tài)、飼養(yǎng)條件等小鼠30只，依隨機數(shù)字表隨機分為3組，在相同條件下接種菌苗，后觀察存活日數(shù)如下表。

9D11CDSC1257461138625671097752121156646347104、隨機區(qū)組設(shè)計；也稱配伍組設(shè)計。是配對比較設(shè)計的擴大。將全部動物按體重、性別及其它條件等分為若干組，每組中動物體質(zhì)條件相似，再將每個區(qū)組中的每一只動物進(jìn)行編號，利用隨機數(shù)字法將其分配到各組。配對設(shè)計的每一“對子”分別給予兩種處理，而配伍組設(shè)計中的每一“配伍組”包含多個受試對象，分別給予多種處理。適用于總體同質(zhì)性差，部分同質(zhì)性好。 優(yōu)點：每個區(qū)組內(nèi)的k個受試對象有較好的同質(zhì)性，因此組間均衡性也較好；比完全隨機設(shè)計減少了誤差，因而更容易察覺處理組間的差別，提高了實驗

效率。 缺點是要求區(qū)組內(nèi)實驗單位數(shù)與處理數(shù)相同，抗數(shù)據(jù)缺失能力較低。若一個區(qū)組的某個動物發(fā)生意外，那么整個區(qū)組都得放棄，或不得已采取缺項估計。例：有人用4種不同種系的未成年大鼠做實驗，每一種以

同窩雌性大鼠3只，隨機分配注射3種不同劑量的雌性激素

(mg/100g)后，在相同條件下稱其子宮重量(g)，見表：

大鼠種系0.20.40.8116116145242681153701111334423584805、拉丁方設(shè)計：用r個拉丁字母排成r行r列的方陣，使每行每列中的每個字母都只出現(xiàn)一次，這樣的方陣叫r階拉丁方，或r×r拉丁方。這種分別按拉丁字母、行和列安排處理因素及影響因素的實驗稱為拉丁方實驗。它必須是3因素試驗，且3種因素各有r個水平。優(yōu)點：可以大大減少實驗次數(shù)，比配伍組設(shè)計更進(jìn)一步，是雙向的誤差控制，尤其適合于動物和實驗室實驗。缺點是要求處理數(shù)必須等于拉丁方的行（列）數(shù)，一般的實驗不容易滿足此條件，而且數(shù)據(jù)丟失會增加統(tǒng)計分析難度。由于每種處理的重復(fù)數(shù)較少，對差別的估計可能不夠精確。例：蛇毒的抑瘤實驗：4x4拉丁方實驗12341ABCD2BADC3CDAB4DCBA12341CBAD2DABC3ADCB4BCDAⅠⅡⅢⅣ1CBAD2ADCB3DABC4BCDA1，3兩列對調(diào)2，3兩行對調(diào)：基本方隨機化基本方劑量成份（峰）瘤株瘤株（處理）A（肉瘤180）B（肝肉瘤）C艾氏腹水瘤）D（網(wǎng)狀細(xì)胞瘤）成份（峰）ⅠⅡⅢⅣ劑量（mg/kg）1（0）2（0.03）3（0.05）4（0.075）6、正交設(shè)計：是研究多因素試驗的一種設(shè)計方法。其特點是利用一套規(guī)格化的表格——正交表來安排實驗，適用于多因素、多水平、實驗誤差大、周期長等一類實驗的設(shè)計。設(shè)計過程中只要根據(jù)實驗條件直接套用正交表

即可，而不需要另行編制。正交表在統(tǒng)計學(xué)書上都可查到。以L9（34

）為例說明其意義及使用方法：L代表正交表，右下角9字表示這張表需安排9次實驗。括號內(nèi)3表示這張表使用于三水平的實驗，指數(shù)4表示最多可以安排4個因素的實驗。總的來說用這張表進(jìn)行實驗設(shè)計，最多可以安排4個因素，每個因素取3個水平，一共進(jìn)行9次實驗。五、實驗數(shù)據(jù)的處理與分析（一）參數(shù)估計：實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述1、算術(shù)平均數(shù)：表示一組觀察值（或變量）的集中趨勢、中心位置或平均水平的指標(biāo)。2、標(biāo)準(zhǔn)差：表示一組變量值離散程度（dispersion）的指標(biāo)，均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)合能更全面地說明一組變量的分布情況。3、率：表示一定條件下某種現(xiàn)象實際發(fā)生數(shù)與可能發(fā)生數(shù)的比。4、構(gòu)成比：又稱構(gòu)成指標(biāo)，表示事務(wù)或現(xiàn)象內(nèi)部各構(gòu)部分的比重。常稱百分比。（二）假設(shè)檢驗：顯著性檢驗方法1、計量資料的分析方法：t檢驗：生物學(xué)研究中，由于實驗條件和研究對象的限制，有許多研究的樣本容量很難達(dá)到30，因此常采用小樣本平均數(shù)的t檢驗。u檢驗法：對于樣本數(shù)大于30，且能獲知總體方差時可采用u檢驗法。F檢驗：而對于單因素樣本（水平數(shù)k≧3）或兩個及兩個以上因素的實驗數(shù)據(jù)則必須采用F檢驗。2、計數(shù)資料的分析方法；計數(shù)資料的顯著性檢驗大部分采用χ2檢驗。根據(jù)研究目的不同可分為適合性檢驗和獨立性檢驗。適合性檢驗：檢驗?zāi)承誀钣^察次數(shù)與該性狀的理論比率是否符合。獨立性檢驗：是研究兩類試驗因子之間是相互獨立還是相互影響的，也就是對次數(shù)資料的相關(guān)性進(jìn)行研究。這類數(shù)據(jù)資料的其它分析檢

驗方法（如四格表精確檢驗法）請參閱有關(guān)統(tǒng)計學(xué)專著。3、統(tǒng)計軟件的應(yīng)用：如SPSS。第四部分、常用實驗動物的選擇實驗動物的選擇是動物實驗研究中首要考慮的問題之一。不同實驗的研究目的和要求不同，不同種類實驗動物也有其各自的生物學(xué)特點和解剖生理特征。為保證動物實驗研究中使用最適宜的實驗動物，選擇動物應(yīng)遵循以下原則：1、相似性原則：是指利用動物與人類某些機能、代謝、結(jié)構(gòu)及疾病特點的相似性選擇

實驗動物。動物實驗的目的是利用動物與人類近似的特性通過動物的

反應(yīng)來推斷人類的病理和生理進(jìn)程特點，尋找預(yù)防及治療方法，因此，動物的物種進(jìn)化程度在選擇實驗動物時是優(yōu)先考慮的問題。在可能的

情況下，應(yīng)盡量選擇在結(jié)構(gòu)、機能、代謝及疾病特征方面與人類相近的動物做實驗。組織結(jié)構(gòu)：哺乳動物之間有許多組織結(jié)構(gòu)上的相似點，因而其生命功能基 本過程也很相似。例：豬，皮膚組織結(jié)構(gòu)與人類相似，其上皮再生、皮下 脂肪層、燒傷后的內(nèi)分泌及代謝特點等也都類似人類，故選用小型豬做燒 傷實驗研究較為合適。系統(tǒng)機能：許多動物各系統(tǒng)的功能與人類是相似的。例：犬，其具有發(fā)達(dá) 的血液循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)，毒理方面的反應(yīng)與人類也比較接近，適于做實驗 外科學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、藥理毒理學(xué)、行為學(xué)等方面的研究。蛙和蟾蜍：大腦不 發(fā)達(dá)，不能用于高級神經(jīng)活動研究，但做簡單的反射弧實驗很合適，且結(jié) 構(gòu)簡單明了，易于分析。生理特性：兩棲類和爬行類是變溫動物，因此不適合做提問調(diào)節(jié)研究；獼猴的生殖生理和人非常接近，月經(jīng)周期和人一樣約28天左右，是研究人類避孕藥的理想動物。體液成分：動物的血液性狀、糞便、汗和尿液的理化性質(zhì)、成分構(gòu)成也大都具有各自的特點。例如尿液的滲透壓和酸堿度。繁殖特性：如家兔的卵巢幾乎連續(xù)不斷地產(chǎn)生卵子，但成熟的卵泡只有 經(jīng)過雄兔交配后才能排卵，因此可選用成年雌兔來誘發(fā)排卵，是觀察藥 物對排卵的影響，進(jìn)行避孕藥研究的常用動物。解剖特性：骨骼構(gòu)成、臟器構(gòu)成、臟器形態(tài)等方面：例，豬的齒式與人 類相似；肉食類和草食類動物的腸道長度；魚類、兩棲類、爬行類、鳥 類和哺乳類的心臟特點，在形態(tài)和機能上與人的心臟最類似的是犬。疾病特點：一些帶有自發(fā)性疾病的動物，可以局部或全部地反映人類類似疾病過程表現(xiàn)，經(jīng)過遺傳育種的方法，可把這種動物培育成疾病的模型動物，以供研究。如，遺傳性高血壓大鼠、糖尿病小鼠等。突變系

SHR大鼠其自發(fā)性高血壓的變化與人類相似，并伴有高血壓性心血管病變。猴對痢疾桿菌敏感，是研究痢疾的最好模型。黑熱病地區(qū)的家犬也感染利朵曼氏原蟲發(fā)病，犬當(dāng)然就成為研究黑熱病的最好實驗動物。2、特殊性原則：是指利用不同種系實驗動物機體存在的特殊構(gòu)造或某些特殊反應(yīng)選擇解剖、生理特點符合實驗?zāi)康暮鸵蟮膭游?。有時這種選擇是保證實驗成功的關(guān)鍵。恰當(dāng)?shù)厥褂镁哂心承┙馄噬硖攸c的實驗動物，有時還能大大地減少實驗準(zhǔn)備方面的麻煩，降低操作難度。Example：大鼠無膽囊，不會嘔吐，不能做膽功能觀察或催吐實驗。狗、貓、猴等動物嘔吐反應(yīng)敏感，則宜選用。家兔對體溫變化十分敏感，宜選做發(fā)熱、解熱和檢查熱原的實驗研究，大鼠、小鼠體溫調(diào)節(jié)不穩(wěn)定，不宜選用。一般動物可自身合成維生素C，豚鼠則不能合成，因而可用來做Vc缺乏試驗。大鼠垂體——腎上腺系統(tǒng)功能發(fā)達(dá)，應(yīng)激反應(yīng)靈敏，適于作應(yīng)激反應(yīng)和垂體，腎上腺、卵巢等內(nèi)分泌實驗研究。大鼠肝臟的枯否氏細(xì)胞90%有吞噬能力，肝臟再生能力很強，切除60～70%的肝葉，仍有再生力，適于肝外科實驗研究。大鼠對炎癥反應(yīng)靈敏，特別是踝關(guān)節(jié)對炎癥反應(yīng)

更敏感，適于多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和化膿性淋巴腺炎的研究，也適于中耳疾病

和內(nèi)耳炎的研究。不同藥物或化合物在不同種系動物上引起的反應(yīng)有時存在很大差異， 如嗎啡對家犬、兔、猴、大鼠和人主要作用是中樞抑制，而對小鼠和 貓主要作用是興奮。苯胺及其衍生物對家犬、貓和豚鼠能引起與人相 似的病理變化，產(chǎn)生變性血紅蛋白，但對家兔則不易產(chǎn)生變性血紅蛋 白，在鼠則完全不產(chǎn)生。這在選擇實驗動物時必須注意。不同品系動物，對同一刺激的反應(yīng)差異很大，在選擇時也必須注意。如C57BL小鼠對腎上腺皮質(zhì)激素的敏感性比DBA及BALB/C小鼠高

12倍。DBA小鼠對音響刺激非常敏感，可發(fā)生聽源性痙攣，而

C57BL小鼠卻根本不會出現(xiàn)這種反應(yīng)。實驗時應(yīng)充分了解動物特性，選擇敏感性強、對實驗結(jié)果干擾小的動物品系。3、標(biāo)準(zhǔn)化原則：是指選擇和使用與研究內(nèi)容相匹配的標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物。只有選用經(jīng)遺傳學(xué)、微生物學(xué)、環(huán)境及營養(yǎng)控制的標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物，才能排除微生物、潛在疾病等因素對實驗結(jié)果的影響，使實驗具有重復(fù)性、一致性和忠實性。遺傳學(xué)控制要求選擇何種遺傳群體動物，應(yīng)根據(jù)不同課題內(nèi)容而定。近交系動物遺傳純合度高，個體差異小，特征穩(wěn)定，對實驗反應(yīng)一致性好，實驗結(jié)果精確可靠。以群體為研究對象的研究課題，如人類遺傳學(xué)研究，藥物篩選和毒性實驗中要選擇與人群基因型及表現(xiàn)型相似的動物類別，封閉群則更為合適。

F1代生活力強，帶有兩個親本品系的特性，個體間的遺傳型和表型一致，是理想的品系，但價格較貴。（2）微生物控制要求：普通級動物具有價廉、易獲得、飼養(yǎng)設(shè)施簡便、容易管理等特點，但用于研究

所獲得的實驗結(jié)果的反應(yīng)性差，微生物控制難度也大，一般用于示教和預(yù)實驗。清潔級動物：較為常用，適用于大多數(shù)科研工作，但趨勢是取消。SPF動物是正常的健康無病模型，可排除疾病或病原的干擾，適用于所有科研實驗、生物制品和藥品生產(chǎn)及檢定，是國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實驗動物。涉及具有國際交流意義的重大課題，最好選用SPF動物。無菌和悉生動物是一種超常生態(tài)模型，非常規(guī)實驗動物，僅適用于特殊實驗?zāi)康?。如微生物與宿主、微生物之間的關(guān)系。普通動物、SPF動物與無菌動物特點比較━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━實驗項目 普通動物

SPF動物 無菌動物━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━傳染病有或可能有無無寄生蟲有或可能有無無實驗結(jié)果有疑問明確明確應(yīng)用動物數(shù)多(或大量)少數(shù)少數(shù)統(tǒng)計價值不準(zhǔn)確可能好好長期實驗困難可能好可能好自然死亡率高低很低長期實驗存活率約40%約60%約100實驗的準(zhǔn)確設(shè)計不可能可能可能實驗結(jié)果討論價值低高很高%━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━各種實驗條件和實驗動物品質(zhì)相匹配：選用與實驗設(shè)計、技術(shù)條件、實驗方法等條件相匹配的標(biāo)準(zhǔn)化動物。既 要避免高精尖的儀器、試劑、技術(shù)方法等與低規(guī)格、非標(biāo)準(zhǔn)化、反應(yīng)性 能低的動物相配，又要防止低性能測試手段、非標(biāo)準(zhǔn)化的實驗設(shè)施等與 高級別、高反應(yīng)性能的動物相配，造成不必要的資源的浪費。這種匹配 的協(xié)調(diào)性反映在生物反應(yīng)性、實驗技術(shù)構(gòu)成、動物品系、體型、年齡、 性別、行為特質(zhì)等。4、規(guī)格化原則：是指選擇與實驗要求一致的動物規(guī)格。由于不同動物對外界刺激的反應(yīng)存在著個體差異，選擇時，除了注意動物的種類及品系外，還應(yīng)考慮動物的年齡、體重、性別、生理及健康狀況等，符合規(guī)格，這也是保證實驗結(jié)果可靠性和可重復(fù)性的一個重要環(huán)節(jié)。犬與人的年齡對應(yīng)年齡對應(yīng)(年)犬12345678910111213141516人152428344042444852566064687276801）年齡不同品種和品系的實驗動物其壽命各不同，有的以日,有的以月,有的以年計算。如果對犬和小鼠均觀察一年，所反應(yīng)的發(fā)育過程是不同的，即使同樣是犬，不同的年齡階段所得的實驗數(shù)據(jù)也不盡相同。所以選用實驗動物時，應(yīng)注意到實驗動物之間、實驗動物與人之間的年齡對應(yīng)，以便進(jìn)行分析和比較。部分實驗動物的年齡對照表2）體重動