一種快速、簡易、精確的蛋氨酸測定方法

一種快速、簡易、精確的蛋氨酸測定方法

氨基乙酸鈉也稱為甲基硫酸鈉，是體內(nèi)甲基的主要供體，也是唯一含有硫醚的氨基酸。其生理功能主要表現(xiàn)在:參與體內(nèi)甲基的轉(zhuǎn)移;維持機(jī)體生長發(fā)育和氮平衡,在臨床上可用于防治肝臟疾病、治療蛋白質(zhì)不足引起的營養(yǎng)不良癥等癥狀。因此蛋氨酸在飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、保健品行業(yè)以及食品行業(yè)具有廣泛用途。作為動(dòng)物體生長過程的必需氨基酸和飼料添加劑的主要成分之一,與化學(xué)合成法相比,應(yīng)用微生物發(fā)酵生產(chǎn)具有更廣闊的前景,但蛋氨酸在微生物體內(nèi)含量極低,需選育一株高產(chǎn)蛋氨酸的菌株。在選育過程中,建立一條簡便、快速且靈敏度高的檢測方法意義重大。目前蛋氨酸的測定方法主要有硝普鹽法1材料和方法1.1氯銨-t反應(yīng)前后ntb的量的比色測定過量的氯銨-T與蛋氨酸發(fā)生氧化反應(yīng),生成蛋氨酸亞砜;剩余的氯銨-T氧化NTB生成DTNB。當(dāng)NTB過量時(shí),與氯銨-T反應(yīng)后剩余的NTB的量在一定范圍內(nèi),其OD值與加入的蛋氨酸的量成正比。在氯銨-T為0.03ml,NTB為0.2ml,蛋氨酸在7.5～25μg范圍內(nèi)符合比爾定律,可在412nm處進(jìn)行比色測定。其反應(yīng)過程如下:蛋氨酸+Ch-T(氯銨-T)→蛋氨酸亞砜氯銨-T+NTB→DTNB1.2儀器及試劑1.1.1儀器試管,移液管,分析天平(0.1mg),722型分光光度計(jì)。1.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(1)0.1mol/L的pH=8.0的磷酸鹽緩沖液,冷藏保存;(2)0.5mg/ml的EDTA(Augus)溶液,由(1)配制,冷藏保存;(3)0.1mg/ml的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,由(2)配制,冷藏保存;(4)0.01mol/L氯銨-T(Sigma-Aldrich)水溶液,冷藏保存;(5)DTNB(5,5’—二硫代雙(硝基苯甲酸),Sigma)貯液:4mg/ml,由(2)配制,冷藏保存;(6)NTB溶液(新鮮配制):DTNB貯液用少量硼氫化鈉還原,鹽酸溶液中和過量硼氫化鈉由,直至無氣體產(chǎn)生,磷酸鹽緩沖液5～10ml調(diào)節(jié)pH值至8.0。(7)DEPC(焦碳酸二乙酯)(Sigma),冷藏保存;(8)硼氫化鈉(北京化學(xué)試劑公司,分析純),室溫保存。1.3depc與ntb法(1)取0.1mg/ml的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25ml于試管中,加EDTA溶液定容至1.0ml,同時(shí)均加入10μlDEPC作為掩蔽劑,室溫過夜;(2)在(1)中加入3.0ml磷酸鹽緩沖液和0.03ml的氯銨-T溶液,室溫反應(yīng)40min后,再加入0.2mlNTB溶液,以試劑空白為對照,于412nm下測其OD值。繪制OD—蛋氨酸含量(μg)標(biāo)準(zhǔn)直線。2結(jié)果與討論2.1標(biāo)準(zhǔn)的蛋酸含量蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)直線如圖所示:其相關(guān)系數(shù)R=0.9993,可作為測定標(biāo)準(zhǔn)直線,簡便、準(zhǔn)確地測定蛋氨酸含量。2.2回收率的測定在常規(guī)的蛋氨酸測定中,容易受到其他氨基酸尤其是含硫氨基酸的干擾,而本測定方法,很大程度上消除了以上干擾,為了驗(yàn)證其抗干擾性及測定準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)選定了幾種含巰基的物質(zhì)(如谷胱甘肽、半胱氨酸)作為干擾物質(zhì),進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。2.2.1谷胱甘肽的消除作用巰基還原性極強(qiáng),能被弱氧化劑氯銨—T迅速氧化,因此蛋氨酸與氯銨-T的反應(yīng)受半胱氨酸等含巰基氨基酸以及谷胱甘肽的干擾。采用DEPC作為掩蔽劑,可有效消除其干擾作用,同時(shí)本實(shí)驗(yàn)確定了可消除的谷胱甘肽的量,結(jié)果如表1所示。由上表可知,10μl的DEPC可以掩蔽谷胱甘肽的量為25μg,此時(shí)蛋氨酸具有良好的回歸性。2.2.2depc擾蔽結(jié)果半胱氨酸中含有巰基,對蛋氨酸的測定存在干擾。利用DEPC掩蔽的結(jié)果如表2所示。由上表可知,在半胱氨酸量為10μg時(shí),DEPC可以掩蔽體系中半胱氨酸對蛋氨酸的測定的影響。2.2.3谷胱甘肽和精氨酸同時(shí)以可接受無干擾作用量存在的情況DEPC可以掩蔽含巰基物質(zhì)對蛋氨酸測定的干擾作用,對于其他氨基酸同時(shí)存在的情況也進(jìn)行了研究(以精氨酸為例)。在谷胱甘肽和精氨酸同時(shí)以可接受無干擾作用量存在的情況的研究結(jié)果如表3。由上表可知,DEPC對含硫物和不含硫氨基酸均具有掩蔽效果,在谷胱甘肽,精氨酸同時(shí)為掩蔽最大量時(shí),DEPC仍然具有良好的掩蔽效果,蛋氨酸的測定基本不受干擾。若需掩蔽的氨基酸量增加時(shí),是否可以適當(dāng)?shù)脑黾覦EPC的量達(dá)到掩蔽效果,本文未作探討。3微量蛋氨酸和其他氨基酸的絡(luò)合萃取depc測定分光光度法測定蛋氨酸適用于大量的菌種篩選工作。本實(shí)驗(yàn)確定的NTB顯色法存在以下優(yōu)點(diǎn):(1)顯色法靈敏度高,能夠測出微量蛋氨酸;(2)在存在