病原微生物檢測方法

病原微生物檢測方法整理ppt222一，生物化學方法原理：生化方法檢測病原微生物實際上是測定微生物特異性酶。由于各種微生物所具有的系統(tǒng)不完全相同,對許多物質(zhì)的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物來間接檢測該微生物內(nèi)酶的有無,從而達到檢測特定微生物的目的。辛酯酶法：快速檢測沙門氏菌。沙門氏菌能產(chǎn)生辛酯酶,這一性能是除沙門氏菌外的各屬腸桿菌科細菌所不具備的。以4-甲基傘形酮辛酯(MUCAP)為底物,經(jīng)沙門氏菌的辛酯酶降解后,釋放出4-甲基傘形酮(4MU),在紫外燈下觀察其發(fā)出的藍色熒光。2整理ppt333二，血清免疫學方法免疫學技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng),觀察和研究組織細胞、特定抗原(抗體)的定性和定量技術(shù)。為了顯示和觀察這種抗原抗體反應(yīng),需要預先將某種標記物結(jié)合到抗體上,借標記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度,在光鏡或電鏡下進行定性、定位或定量研究。熒光抗體技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)3整理ppt444三，分子生物學方法分子生物學及分子遺傳學的發(fā)展,使人們對微生物的認識逐漸從外部結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)向內(nèi)部基因結(jié)構(gòu)特征,微生物的檢測也相應(yīng)的從生化、免疫方法轉(zhuǎn)向基因水平的檢測。核酸雜交法PCR及其衍生技術(shù)基于16SrRNA的檢測技術(shù)4整理ppt555四，分子生物學與免疫學相結(jié)合的方法免疫PCR(immunopolymerasechainreaction,IMPCR)PCR-ELISA5整理ppt666五，用生物傳感器進行病原微生物的鑒定生物傳感器是將新興的傳感器技術(shù)和分子診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種新技術(shù)。生物傳感器包含兩部分,即分子識別器件和換能器。利用大腸桿菌抗體的免疫吸附反應(yīng),使用集成化SPR傳感器快速檢測大腸桿菌O157:H7,采用親和素-生物素系統(tǒng)放大檢測的反應(yīng)信號,并引入復合抗體作為二次抗體,使該傳感器對大腸桿菌的檢測限由106cfu/ml下降到105cfu/ml。6整理ppt777六，生物芯片生物芯片技術(shù)是將生物大分子,如寡核苷酸cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質(zhì)上形成生物分子點陣,當待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析。根據(jù)芯片上探針的分子種類而將之分為：DNA芯片(即基因芯片)和蛋白質(zhì)芯片。7整理ppt888七，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)用于各種疾病特異性蛋白指紋的識別和判斷,可以直接檢測不經(jīng)處理的尿液、血液或細胞裂解液等。人體血清里有成千上萬個蛋白,人一旦發(fā)生了某種疾病,蛋白質(zhì)成分就必然會起變化?？梢苑治龅贸鯯ARS與非SARS病人血清中的蛋白質(zhì)成分變化。該技術(shù)不是利用單獨的蛋白質(zhì)峰的出現(xiàn)和消失來判斷SARS,而是用5個蛋白質(zhì)峰的出現(xiàn)和消失來判斷,好比刑偵破案中甄別5個手指的指紋,故此稱為“指紋圖譜”。8整理ppt999八，LAMP技術(shù)環(huán)介導等溫擴增(loop—mediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)是近年來發(fā)展出的一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴增技術(shù)。與傳統(tǒng)PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)，為等溫擴增。且由于LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物一白色焦磷酸鉀沉淀，擴增產(chǎn)物可不經(jīng)過電泳，通過肉眼觀察或濁度計即可判定結(jié)果。用于檢測：丙型肝炎病毒(HCV)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS—CoV)、乙腦病毒(JEV)、甲型流感病毒(AIV)、腮腺炎病毒(MV)等。9整理ppt101010謝謝整理ppt111111熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,把熒光素作為抗原標記物,在熒光顯微鏡下檢查呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復合物及其存在部位。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清,經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體,待作用后經(jīng)洗滌,再加入熒光標記的第二抗體。11返回整理ppt121212酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)是根據(jù)抗原-抗體的免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理有機結(jié)合,通過酶催化底物進而發(fā)生一系列的化學反應(yīng),使溶液呈現(xiàn)出顏色變化,從而顯示抗原抗體特異性反應(yīng)的存在。Dot-ELISA法（DIBA法）：Dot-ELISA以纖維素膜代替常規(guī)ELISA中常用的聚苯乙烯酶標板，這種微孔濾膜對樣品吸附量大，且包被牢固，所以樣品用量少，試驗結(jié)果可通過顏色斑點的出現(xiàn)與否和色澤進行判定，不需特殊儀器。12整理ppt131313檢測灰飛虱帶RBSDV的DIBA法131,NC膜用鉛筆畫出0.5cm正方格2,單頭灰飛虱加100ul碳酸鹽緩沖液，用牙簽搗碎，取上清2ul加樣，室溫晾干3,將干燥的NC膜浸入封閉液中，37℃,30min4,取出NC膜，浸入用封閉液稀釋10000倍的單抗體中，37℃,1.5h5,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每次5min6,將膜浸入用封閉液稀釋5000倍的酶標二抗中，37℃,1.5h7,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每次5min8,將膜浸入HRP底物顯色液中，37℃,30min，顯色后，用自來水沖洗，室溫晾干返回整理ppt141414核酸雜交法原理：是通過標記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針，與病原體核酸片段雜交,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號。核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、Southern雜交、Northern雜交等。核酸分子探針又可根據(jù)它們的來源和性質(zhì)分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。14整理ppt151515斑點雜交被廣泛用于檢測植物或介體帶毒及核酸同源性。如果用于檢測RNA樣品，稱為Northern雜交；如果用于檢測DNA樣品，稱為Southern雜交。操作程序如下：1,從病株材料中提取少量汁液。如果病毒核酸為雙鏈，通過加熱使其變性。2,點樣。將病株汁液滴在NC膜上或尼龍膜上。3,烘烤纖維素膜，使核酸牢固地結(jié)合到纖維膜上。4,用蛋白和非特異性小分子DNA溶液混合進行預雜交約2小時，封閉膜上的非特異性位點。5,用標記的核酸探針與膜上樣品在封閉塑料袋中進行雜交過夜，水浴65℃。洗膜后進行放射自顯影分析。15整理ppt161616斑點雜交16DNA/RNA樣品放射自顯影檢測點樣Probe-32PAB1234整理ppt171717SouthernBlot17返回整理ppt181818PCR及其衍生技術(shù)PCR技術(shù)又稱體外擴增技術(shù),具有高度的靈敏性和良好的特異性。。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)、RFLP、RAPD技術(shù)、熒光定量PCR等。以PCR為基礎(chǔ)的DNA測序分析可用于病原菌的鑒定和亞型的區(qū)分,以及同種病原菌不同菌株的區(qū)分。18整理ppt191919191.檢測單頭蚜蟲帶(bydv-gpv)的pcr法1,病毒核酸樣品制備。取單頭飼毒(GPV)的禾谷縊管蚜加10ulTris-HCl(pH7.4)研磨，加入10ul苯酚和10ul氯仿，再次研磨，12000rpm離心2min,得到約10ul上清液。2,cDNA合成。取1ul上清液(含GPV)依次加入1ulGPVCP序列引物(1)，2ul5XMMLV緩沖液，6ul雙蒸水，混勻，進行80℃1min和50℃5min反應(yīng)。再加入2ul10mMdNTPs,1ulRNase，1ul100mMDTT，1.3ul50mMMgCl2，2.1ulMMLV.R.Tase，加雙蒸水至反應(yīng)體系為20ul，進行37℃30min和100℃1min反應(yīng)，即得到cDNA。整理ppt202020201.檢測單頭蚜蟲帶(bydv-gpv)的pcr法3,PCR。10ulcDNA中加入5ul10XPCR緩沖液，2ul50mMMgCl2，0.15ul引物(1)，0.15ul引物(2)，2ul10mMdNTPs，0.5ulTaq聚合酶，加水至20ul。在PCR儀中進行35個94℃(45s)-50℃(30s)-72℃(2min)擴增循環(huán)，程序結(jié)束后，調(diào)至72℃保持10min，在-20℃保存擴增產(chǎn)物。4,擴增產(chǎn)物的電泳分析。取10ulPCR產(chǎn)物在1﹪瓊脂糖凝膠中電泳，0.1﹪EB染色20min，紫外線下檢測，拍照。整理ppt21212121Pcr擴增程序圖整理ppt2222222.檢測乙肝cccDNA的PCR法原理：乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(hepatitisBviruscovalentlyclosedcircularDNA，HBVcccDNA)是乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)復制的中間體，是HBVmRNA和前基因組RNA合成的模板。細胞外乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)分子，其兩條鏈均不閉合，其中負鏈較長，約3200個堿基，含有乙肝病毒基因組的全長基因，在其5’起始端與3’末端之間有一個包含數(shù)個堿基的“缺刻”(nick)；正鏈較短，有較大的“缺口”(gap)，其3’末端不固定，故長度是可變的。22整理ppt232323嵌合引物熒光PCR法Jun—BinS等在利用Taqman探針進行的熒光定量PCR檢測中設(shè)計了一條特殊的嵌合引物。該引物由兩個片段連接而成，3’端是與HBVDNA正鏈DR2區(qū)前的序列互補的A片段，5’端的B片段是與HBV基因組沒有同源性的HBV基因組的部分序列。cccDNA因為正鏈完整，引物與正鏈的特定區(qū)域雜交后，在DNA聚合酶的作用下，引物能夠順利延伸形成一條新生鏈，而HBVDNA的其他形式，如rcDNA，引物的延伸停止于DR2區(qū)。新生鏈形成以后，設(shè)計另一對引物，一個與嵌合性引物的片段B雜交，另一個與正鏈DR2后的序列互補，進行PCR擴增。實時PCR儀通過探針釋放的熒光強度進行cccDNA定量。23返回整理ppt242424基于16SrRNA的檢測技術(shù)16SrRNA存在于所有原核生物細胞中,它們相對穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)(每個細胞幾千個拷貝),其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū),因此可設(shè)計群、屬、種特異性的探針?，F(xiàn)階段各種常見細菌的16SrRNA基因幾乎全部測序完成,16SrRNA編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列。24返回整理ppt252525免疫PCR該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機結(jié)合起來,它的基本原理是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應(yīng),PCR擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無,來判斷待測抗原是否存在。25返回整理ppt262626PCR-ELISAPCR-ELISA法是PCR