木二糖組分法鑒定

木二糖組分法鑒定

目前，低聚糖功能的開發(fā)已成為研究的重點(diǎn)，低聚糖就是其中之一。低聚木糖是由2～9個(gè)木糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的低聚糖,它除了具有低熱、穩(wěn)定、無毒等特性外,還具有獨(dú)特的生理功能。它促進(jìn)人和動(dòng)物腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖,抑制有害菌的生長,并能促進(jìn)鈣的吸收。因此,將低聚木糖作為功能性食品添加劑,具有開拓市場的前景。半纖維素經(jīng)木聚糖酶(EC.3.2.1.8)水解后,產(chǎn)物為多種低聚木糖的混合物,其中還有少量的木糖和阿拉伯糖。在低聚木糖的生產(chǎn)過程中,為了對反應(yīng)過程進(jìn)行控制和優(yōu)化以及對產(chǎn)品得率進(jìn)行分析,需用標(biāo)準(zhǔn)的低聚糖對產(chǎn)品進(jìn)行定量測定,木二糖則是常用的標(biāo)準(zhǔn)試劑。而木二糖作為生化試劑,國內(nèi)尚無正式產(chǎn)品,供色譜標(biāo)準(zhǔn)用的進(jìn)口木二糖價(jià)格昂貴,Sigma公司純度為95%的木二糖5mg的售價(jià)超過2000元人民幣,這就大大提高低聚木糖研究和開發(fā)的成本。因此,分離提純木二糖是很具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的。在眾多的分離提純方法中,柱層析技術(shù)是純化低聚木糖相對有效的方法。本文報(bào)道以玉米芯半纖維素為原料,經(jīng)木聚糖酶制劑(LDA3)水解后,酶解液用葡聚糖凝膠SephadexG-10柱層析技術(shù)分離提純木二糖及其高效液相色譜(HPLC)分析鑒定。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇黑曲霉(Aspergillusniger),由本課題組自行篩選和保存,并用于木聚糖酶的生產(chǎn)。1.1.2水溶液中水溶液聚合物的制備將粉碎并過篩的玉米芯原料,用清水充分浸濕溶脹后離心去除水分。此時(shí)原料中水溶性物質(zhì)大部分被脫去,再以10:1(v/w)的液固比,加入堿,堿濃度控制在3%～10%,室溫下,攪拌浸提15～30h。溫度70～90℃時(shí),攪拌浸提1～3h。離心去除固形物,收集濾液,并用磷酸緩沖液中和至微酸性。1.1.3木聚糖酶的生產(chǎn)和制備木聚糖酶生產(chǎn)采用固態(tài)發(fā)酵法,參見文獻(xiàn);酶制劑的制備參見文獻(xiàn)。1.2主要設(shè)備和試劑1.2.1傅立葉變換紅外光譜儀LC-4A高效液相色譜儀(日本島津公司產(chǎn)品);Spectrum1000傅立葉變換紅外光譜儀(美國PE公司產(chǎn)品);721型分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠產(chǎn)品)等。1.2.2csisigaSephadexG-10(Phermacia公司產(chǎn)品);標(biāo)準(zhǔn)木二糖(Sigma公司產(chǎn)品);其余試劑均為分析純。水及乙腈經(jīng)二次蒸餾,過0.45μm微濾膜,并經(jīng)超聲波脫氣。1.3流動(dòng)相及柱溫SephadexG-10柱,?2.5cm×120cm;蒸餾水為流動(dòng)相,流速為10ml/h;柱溫為30℃;洗脫液收集每10min一管。1.4分析定義器1.4.1糖含量的測定以木糖為標(biāo)準(zhǔn),采用DNS法。1.4.2色譜分離條件低聚木糖樣品液經(jīng)適當(dāng)濃縮,用0.22μm微濾膜過濾后,取10μl進(jìn)樣分析。色譜分離條件為:色譜柱,Hypersil-NH2(200×4.6mm,5μm);流動(dòng)相,乙腈∶水=65∶35(v/v);流量,1.0ml/min;柱溫,室溫;檢測器,示差折光;靈敏度,1.6×10-4RIFUS。2結(jié)果與討論2.1高效液相色譜分析將本室制備的木聚糖酶按一定比例加入到玉米芯半纖維素中,在50℃下酶解2h,取酶水解液經(jīng)離子交換柱脫鹽,真空濃縮后,4000r/min下離心15min,上清液過0.22μm膜,取10μL進(jìn)行高效液相色譜分析,結(jié)果見圖1。由圖1可知,酶解液中有八種糖,即木糖到木八糖,其中木二糖含量較高。2.2還原糖濃度的測定及分離效果的分析按常規(guī)方法將SephadexG-10凝膠溶脹,漂洗,脫氣后裝柱,用1000ml蒸餾水平衡層析柱,將糖液濃縮后進(jìn)樣,注意樣品溶液高度不超過2cm,否則容易造成峰擴(kuò)張,組分分不開。經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn),最后確定以蒸餾水為流動(dòng)相,流速為10ml/h,柱溫30℃,這樣分離效果最好。在洗脫過程中,每10min換一管收集洗脫液,用DNS法測定還原糖濃度。以還原糖濃度為縱坐標(biāo),洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖(見圖2),可初步判斷分離效果的好壞。由圖2可知,在7h之后,出現(xiàn)四個(gè)組分峰,其中3號、4號峰分離效果最好,可能是木二糖和木糖。2號峰分離不完全,但木三糖應(yīng)是主要組分,而8h之前出現(xiàn)的大峰,初步判斷它是木四糖至木八糖的混合糖峰。因?yàn)閺睦碚撋蟻矸治?SephadexG-10能夠分離的分子量范圍是在0～700之間,即木四糖及聚合度更高的低聚木糖在SephadexG-10層析柱上是不能分開的。事實(shí)上,這些判斷已被后面的高效液相色譜分析結(jié)果所證實(shí)。2.3高效液相色譜定性分析為了鑒定層析柱對低聚木糖混合樣的分離效果,根據(jù)圖2中2號、3號和4號峰所處的位置,分別在三個(gè)峰的最高點(diǎn)處取樣,進(jìn)行高效液相色譜定性分析。分析結(jié)果見圖3。從圖3中的三個(gè)色譜圖可以看出,由層析柱分離出的峰3、峰4是很純凈的單一組分。經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品對照分析,證實(shí)了峰3為木二糖,峰4為木糖。而峰2以木三糖為主,還含有少量的木二糖和木四糖。2.4圖1:不同類型的樹,短絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)將柱層析得到的木二糖溶液進(jìn)行真空濃縮干燥,用KBr制片,測定紅外吸收光譜,見圖4。在同樣的條件下測定標(biāo)準(zhǔn)木二糖的紅外光譜,見圖5。將圖4與圖5進(jìn)行比較可知,在3382,2914,1636,1384,1206,1042cm-1處,樣品與標(biāo)準(zhǔn)具有相同的特征吸收峰。表明實(shí)驗(yàn)所提取的木二糖純度較高。3木二糖的回收利用(1)利用葡聚糖凝膠柱SephadexG-10可以將低聚木糖混合樣品中的木二糖分離出來,得到高純度的木二糖。從酶解液到產(chǎn)品,純木二糖的得率為53%。分離條件為:層析柱?2.5