厭氧真菌木聚糖酶粗酶的提取與性質(zhì)研究

厭氧真菌木聚糖酶粗酶的提取與性質(zhì)研究

木聚糖酶（ec3.2.1.8）可以特異性地分解木聚糖。其產(chǎn)物主要是木槿糖、木糖和阿拉伯糖。由于其抗糧因素（木聚糖）的降低，近年來(lái)，作為主要酶的酶制劑，該酶可以廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，并取得了良好的效果。木聚糖酶可由多種微生物產(chǎn)生,目前我國(guó)多集中于黑曲霉、木霉等霉菌木聚糖酶的研究。研究表明,厭氧真菌能產(chǎn)生一系列植物細(xì)胞壁降解酶,如纖維素酶、半纖維素酶(包括木聚糖酶)、酯酶和植酸酶等,在植物纖維降解中起重要作用。目前來(lái)自于好氧霉菌的酶主要只能作用于經(jīng)處理過(guò)的非晶體狀底物,而當(dāng)以濾紙片和麥秸粉作底物時(shí),其降解能力遠(yuǎn)不如厭氧真菌產(chǎn)生的酶。本實(shí)驗(yàn)以一株分離自黑白花種公牛糞樣的高產(chǎn)木聚糖酶的厭氧真菌菌株為材料,對(duì)其木聚糖酶粗酶的提取方法及其性質(zhì)進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1蘑菇試驗(yàn)菌株來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室篩選的木聚糖酶高產(chǎn)菌株,編號(hào)為A4。1.2培養(yǎng)基po種子培養(yǎng)基每1L含NaHCO35g,葡萄糖1g,酵母膏1g,蛋白胨1g,L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5g,0.1%刃天青1mL,無(wú)細(xì)胞瘤胃液170mL,緩沖液A(每100mL含KH2PO40.3g,NaCl0.6g,(NH4)2SO40.3g,CaCl2·2H2O0.04g,MgSO4·7H2O0.06g)、B(每100mL含K2HPO4·3H2O0.4g)各165mL。產(chǎn)酶培養(yǎng)基除不含葡萄糖外,其他成分與種子培養(yǎng)基相同。種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基的底物均為稻草片段(小于3mm),其干物質(zhì)含量為8g·L-1。所有培養(yǎng)基均在厭氧條件下制備和分裝,每瓶90mL,加蓋塑膠塞,并以鋁蓋密封后,121℃滅菌15min。進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí),根據(jù)Zhu等的方法,每瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種10mL已生長(zhǎng)3d的菌種混合懸浮液,39℃靜止培養(yǎng)96h。1.3配制酸調(diào)節(jié)ph可溶性木聚糖的制備:參照Ghangas等的方法,將燕麥木聚糖(Sigma)制成可溶性木聚糖溶液,并用1mol·L-1的乙酸調(diào)節(jié)pH至7,所得溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。木聚糖酶活力的測(cè)定:參照Lowe等的測(cè)定方法,以含有酶液但不含木聚糖底物的反應(yīng)體系作比色對(duì)照。以每分鐘每毫升酶液釋放1μmol木糖的酶量為1個(gè)酶活力單位(U·mL-1)。每分鐘每克蛋白釋放1μmol木糖的酶量定義為1個(gè)酶比活力單位(U·g-1)。蛋白含量的測(cè)定:參照文獻(xiàn)中的Bradford方法,以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。1.4下固體木聚糖酶活力的測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾,4000g離心15min,收集上清液。分別取50mL上清液,在20℃下加入固體(NH4)2SO4使其飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%和75%,充分混合均勻,4℃下放置12h,4000g離心15min,然后分別測(cè)定其上清液及沉淀物中木聚糖酶的酶活力。以上清液及沉淀物中木聚糖酶酶活力的相對(duì)大小確定硫酸銨的最佳鹽析用量。1.5粗酶粉的制備按最佳鹽析用量添加(NH4)2SO4于發(fā)酵上清液中,經(jīng)離心得到粗酶沉淀,然后將其于45℃干燥,制成粗酶粉。取適量干燥粗酶粉溶于蒸餾水中,在0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)中透析除鹽,將得到的粗酶透析液用于酶學(xué)性質(zhì)研究。1.6對(duì)粗酶性質(zhì)的測(cè)量1.6.1反應(yīng)溫度對(duì)酶促過(guò)程的影響將所得粗酶液用0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)適當(dāng)稀釋后,分別在不同溫度(20～70℃)下反應(yīng)30min,測(cè)定其酶活力,以酶活力最高時(shí)的溫度為酶促反應(yīng)最適溫度。1.6.2酶促反應(yīng)最適ph的測(cè)定將粗酶液分別用不同pH值(pH2.2～8.0)的0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當(dāng)稀釋后,在各自對(duì)應(yīng)的pH下測(cè)定其酶活力,以酶活力最高時(shí)的pH為酶促反應(yīng)最適pH。1.6.3不同溫度對(duì)殘余酶活力的影響將粗酶液用0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)適當(dāng)稀釋后,分別在37、50、60和80℃下保溫,每隔10min取樣,快速冷卻至室溫后,按常規(guī)方法測(cè)定殘存酶活力。1.6.4酶活測(cè)定將粗酶液分別用不同pH值(pH2.2～8.0)的0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,或0.05mol·L-1磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0～11.0)適當(dāng)稀釋,4℃放置24h后,測(cè)定其酶活力。1.6.5初始酶活力測(cè)定將粗酶液分別用pH值為3.0、5.0、7.0、8.0的0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當(dāng)稀釋,37℃下保溫,隔適當(dāng)時(shí)間取樣,快速冷卻至室溫后,按常規(guī)方法測(cè)定殘存酶活力,以初始酶活力為對(duì)照。1.7數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示。2結(jié)果與分析2.1不同度對(duì)木聚糖酶的木聚糖酶活力的影響由表1可見,隨(NH4)2SO4飽和度的增加,上清液中木聚糖酶的酶活力逐漸降低。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度為70%時(shí),沉淀物中木聚糖酶活力最高。2.2粗酶泥的提取發(fā)酵上清液經(jīng)70%(NH4)2SO4鹽析后得粗酶泥,然后在45℃下烘干18h得干粉。酶活力測(cè)定表明,該木聚糖酶粗酶的比活力為7562U·g-1。2.3木聚糖酶的特性2.3.1反應(yīng)溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響由圖1可見,該酶在0.1mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)環(huán)境下,酶促反應(yīng)30min的最適溫度為50℃。該酶最適反應(yīng)的pH為5.0～6.0。2.3.2不同保溫時(shí)間的酶活力變化由圖2可見,該酶在37和50℃時(shí)均較為穩(wěn)定,保溫2h酶活力變化較小;在60和80℃保溫10min,酶活力下降很大,尤其在80℃保溫10min后,酶活力只有初始酶活力的5.1%。該酶在pH4.0以下時(shí),活力下降較快,在pH4.0～11.0時(shí),較為穩(wěn)定。2.3.3時(shí),酶活力下降在模擬動(dòng)物體溫37℃及胃腸道pH值條件下,該酶在pH3.0時(shí),酶活力下降較快;pH5.0～8.0時(shí),穩(wěn)定性較好,尤其在pH7.0時(shí),經(jīng)過(guò)24h保溫后,其酶活力依然保留了85%以上(37.69/44.17)(表2)。3木聚糖酶的最適溫度和ph值為5.厭氧真菌可分泌高活性纖維素酶、木聚糖酶和酯酶等多種酶,并在植物纖維降解中起著重要作用。朱偉云等報(bào)道分離自動(dòng)物的厭氧真菌菌株具有較強(qiáng)的降解能力,但有關(guān)其木聚糖酶的研究報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)中厭氧真菌粗酶粉的木聚糖酶比活力為7562U·g-1,高于國(guó)內(nèi)已報(bào)道的黑曲霉(Aspergillusniger)所產(chǎn)木聚糖酶的比活力(3181U·g-1)。Lee等亦曾報(bào)道,瘤胃厭氧真菌產(chǎn)生的木聚糖酶的酶活力,比目前工業(yè)用木聚糖酶制劑生產(chǎn)菌米曲霉(Aspergillusoryzae)所產(chǎn)木聚糖酶的酶活力高3倍。這些結(jié)果均顯示,厭氧真菌是迄今所報(bào)道的產(chǎn)木聚糖酶酶活力較高的菌株之一。在本實(shí)驗(yàn)中,厭氧真菌A4菌株所產(chǎn)的木聚糖酶粗酶的酶促反應(yīng)最適作用溫度為50℃,最適作用pH為5.0～6.0,該結(jié)果與國(guó)外報(bào)道的厭氧真菌菌株Neocallimastixsp.一致,最適作用溫度與大多數(shù)其他來(lái)源的木聚糖酶類似。與已報(bào)道的木霉(Trichoderma)及黑曲霉(Aspergillusniger)所產(chǎn)木聚糖酶相比,該厭氧真菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH更接近中性。在正常體況下,豬和家禽的消化道溫度通常為37～40℃,胃pH1.5～3.5,小腸pH5.0～7.0,大腸接近中性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,厭氧真菌所產(chǎn)的木聚糖酶在37℃環(huán)境條件下穩(wěn)定性較好,在pH4.0～11.0,尤其在pH5.0～8.0范圍內(nèi)能保持較高的酶活力。該結(jié)果說(shuō)明,動(dòng)物