液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定大鼠血漿中木通皂苷d的濃度

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定大鼠血漿中木通皂苷d的濃度

延續(xù)是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥，來(lái)自四川延續(xù)植物的延續(xù)（singetal.c.y.chengetal.）干燥的根。續(xù)斷皂苷類成分是續(xù)斷藥材主要活性成分,其中木通皂苷D含量最高。續(xù)斷皂苷具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用,口服生物利用度較低,藥代動(dòng)力學(xué)方面研究的報(bào)道較少。本文用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)建立了大鼠血漿中藥物濃度的測(cè)定方法,并檢測(cè)了木通皂苷D大鼠灌胃給藥的血藥濃度。1儀器和試劑盒1.1高效液相色譜檢測(cè)軟件3200QTRAP型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件,美國(guó)AppliedBiosystem公司;Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng),包括四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、切換閥,美國(guó)Agilent公司;Eppendorf離心機(jī)(Eppendorf5415D,德國(guó));YKH-型液體快速混合器,江西醫(yī)療器械廠。1.2號(hào):國(guó)木通皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):111685-20103,純度:93.5%),中國(guó)藥品生物制品檢定所;內(nèi)標(biāo)替米沙坦對(duì)照品(批號(hào)074K47102,含量>99.0%),Sigma公司;甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。1.3中國(guó)動(dòng)物部:syxk京雄性SD大鼠,體質(zhì)量180～220g(北京大學(xué)動(dòng)物部),動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2006-0025,飼養(yǎng)條件:室溫21～25℃,濕度50%左右,12h交替照明。2方法和結(jié)果2.1%甲醛-甲醇法色譜柱:XDB-C18柱(5μm,150mm×4.6mm,美國(guó)Agilent公司);流動(dòng)相:5mmol/L乙酸銨含0.1%甲酸(A)-甲醇(B),梯度洗脫(表1);流速:1.0ml/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20μl。2.2木通皂苷z-3-3-菌株白砂糖離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);檢測(cè)方式:正離子檢測(cè)方式;離子噴射電壓:5500V;源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力:50KPa;源內(nèi)氣體2(GS2,N2)壓力:55KPa;氣簾氣體壓力:20psi;離子源溫度:550℃;木通皂苷定量離子對(duì)(m/z):946.4→455.3,定性離子對(duì)(m/z):946.4→437.3(DP電壓:80V;CE電壓:35eV);內(nèi)標(biāo)替米沙坦定量離子對(duì)(m/z):515.1→276.1(DP電壓:35V;CE電壓:50eV)。相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見圖1。2.3溶液的制備2.3.1儲(chǔ)存溶液精密稱取10mg木通皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品,置100ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,配制成100μg/ml的儲(chǔ)備液。2.3.2替米沙坦儲(chǔ)備液的配制精密稱取10mg替米沙坦對(duì)照品,置100ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,配制成100μg/ml的儲(chǔ)備液,取適量替米沙坦儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至100ng/ml。2.4lc-ms/ms分析精密量取血漿樣品50μl置于1.5mlEP管中,分別加入50μl100ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液和50μl甲醇溶液,渦旋1min、離心5min(16100×g),取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析,進(jìn)樣量為20μl。2.5理論與實(shí)踐的確認(rèn)2.5.1木通皂苷d標(biāo)準(zhǔn)使用液中色譜分析取空白大鼠血漿樣本50μl,按2.4項(xiàng)下操作,進(jìn)樣20μl,得色譜圖2-A;將一定濃度的木通皂苷D標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各50μl加入50μl空白大鼠血漿中,依同法進(jìn)行渦旋離心處理后進(jìn)樣,得色譜圖2-B,取大鼠給藥后收集的血漿樣品,按2.4項(xiàng)下操作,得色譜圖2-C。結(jié)果表明,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾木通皂苷D和替米沙坦的測(cè)定。2.5.2單次高壓離心處理分別取木通皂苷D儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋,配制10、30、50、100、200、500、1000ng/ml標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,分別加入空白大鼠血漿溶液和內(nèi)標(biāo)100ng/ml替米沙坦溶液各50μl,按2.4項(xiàng)下進(jìn)行渦旋離心處理,取上清20μl在LC-MS/MS中進(jìn)樣。以標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的實(shí)測(cè)峰值面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對(duì)標(biāo)示濃度(X)加權(quán)最小二乘法(1/x2)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.000116X+0.000762(r=0.9977),線性范圍為10～1000ng/ml,最低定量限為10ng/ml。2.5.3線性關(guān)系法對(duì)木通皂苷d質(zhì)量控制單因素試驗(yàn)按2.5.2項(xiàng)下操作,制備濃度分別為30、100、800ng/ml的木通皂苷D質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度6個(gè)樣本,連續(xù)測(cè)定3d,根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度,計(jì)算相對(duì)誤差(RE)和日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(表2)。2.5.4回收率計(jì)算及相關(guān)峰面積取空白血漿50μl,制備濃度分別為30、100、800ng/ml的質(zhì)控樣本,每濃度3個(gè)樣本;同時(shí)另取空白血漿50μl,經(jīng)甲醇沉淀蛋白后將上清液40℃下氮?dú)獯蹈?加入50μl蒸餾水,再加入相應(yīng)濃度的質(zhì)控和內(nèi)標(biāo)溶液,處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析,獲得回收率樣本相應(yīng)峰面積;以蒸餾水代替空白血漿,按回收率樣本前處理方法進(jìn)行樣本前處理,進(jìn)行LC-MS/MS分析,獲得基質(zhì)效應(yīng)樣本相應(yīng)峰面積。按下列公式計(jì)算:提取回收率=質(zhì)控樣本峰面積/回收率樣本峰面積×100%基質(zhì)效應(yīng)=(1-回收率樣本峰面積/基質(zhì)效應(yīng)樣本峰面積)×100%木通皂苷D30、100和800ng/ml3個(gè)濃度提取回收率分別為(108.1±9.5)%、(95.3±9.9)%和(103.6±8.6)%,內(nèi)標(biāo)替米沙坦提取回收率為(96.5±3.2)%。木通皂苷D和內(nèi)標(biāo)替米沙坦低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為-8.57%、-1.96%、-3.63%,內(nèi)標(biāo)替米沙坦的基質(zhì)效應(yīng)為-2.38%。結(jié)果顯示,血樣中木通皂苷D和內(nèi)標(biāo)替米沙坦提取回收率均較高且穩(wěn)定,血樣中基質(zhì)對(duì)木通皂苷D和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的基質(zhì)效應(yīng)較小,均不影響準(zhǔn)確測(cè)定。2.6血漿樣本的制備取雄性SD大鼠6只,經(jīng)口灌胃給予木通皂苷D水溶液,給藥劑量為100mg/kg,于20、40min和1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h眼眶取靜脈血約0.5ml置于肝素化EP管中,5900×g離心10min,取上清血漿樣本50μl,按2.4項(xiàng)下處理,取上清20μl在LC-MS/MS中進(jìn)樣。將實(shí)測(cè)峰值面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算血藥濃度,平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。3色譜條件優(yōu)化木通皂苷D為皂苷類化合物,大鼠經(jīng)口灌胃給藥生物利用度較低,很難用高效液相紫外檢測(cè)的方法進(jìn)行體內(nèi)血漿樣本的分析。LC-MS/MS與之相比具有明顯的優(yōu)越性,檢測(cè)靈敏度高,專屬性強(qiáng),需用血漿量較少,為木通皂苷D的臨床前研究提供了穩(wěn)定可靠而又方便易行的檢測(cè)手段。LC-MS/MS法檢測(cè)血漿樣本中木通皂苷D濃度文獻(xiàn)報(bào)道很少,Li等報(bào)道的方法母離子使用[M+Na]+峰。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)正離子掃描圖中無(wú)特征分子離子峰,[M+Na]+峰響應(yīng)最高,但測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定。而[M+NH4]+峰響應(yīng)雖然較[M+Na]+低,但穩(wěn)定性良好,通過(guò)色譜條件的優(yōu)化可以滿足檢測(cè)要求。皂苷類化合物[M+Na]