凝膠成像及quantityone中文操作說明

第一章簡介凝膠電泳是每個(gè)做分子生物學(xué)的研究者天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件QuantityOne(Bio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest)。QuantityOne軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強(qiáng)大，自動(dòng)化程度最高的軟件。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)()免費(fèi)下載，以供試用或用戶升級之用。QuantityOne軟件的主要功能包括定量分析(VolumesQuickGuide)，電泳條帶分析(BandAnalysis)，差顯分析(DifferentialDisplayAnalysis)，克隆計(jì)數(shù)(ColonyCountingAnalysis)等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動(dòng)切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。TvluvSQvickG<idi箏R科n<hwu2機(jī)9VcUwAn^rttsRflwt7KMeW漸幃岫：Qikkkku?a也怪■與描備卜-,也MbwV九tditVjinK**t>5*1*2”疝r(nóng)^wt [indk擊1]z曲亦utJunntityOneRttisltr...3CuwiityOjw-4=G真Criterion(Kav1-DImec)ydsCiTitw.tikhiIMh總等窗口徵杪回0面0□"?gg?~QuantityOne軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。Q^igitityQu.Etii(QuickGuidtErintiniftuick(njidt■，V?lipfE加kk由iW加力”“5”k飆記中G以好￥0w1ti牌 ^aid-ciDijftrfntialBiiphyQuidk,如d,Fhyl小種士tic：*[rte 莊ileV!T1?m^^I*1idsetScanriBf..Open..EOCftBCo!Twsffflk."加顓照twVcAjmaEe?hardTodVcftjfflflLorttnxToriSdctHo。1插入密碼狗，打開QuantityOne軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜單欄和工具欄。File 圖像打開、保存、引入、打印 Ma 分子量估算、條帶匹配分析等操作 tchEdit 圖像普通編輯操作 Vo 定量分析lumn

View 圖像縮放、三維視圖、看光密An 濃度估算、克隆計(jì)數(shù)等分析alysis度值等操作alysis分析結(jié)果輸出窗口分析幫助、快捷菜單、軟件注冊Imag 分析結(jié)果輸出窗口分析幫助、快捷菜單、軟件注冊eLane泳道分析 :，ndowBand 條帶分析 Help等每個(gè)菜單的主要功能如下:往下一行是工具欄，上面每個(gè)按鈕的功能見下表:身甲打開文儕DO]口+-1圖像顯示控胡札條帶分析工具保存操碗叫顯示條帶口匹配工具打印圖像卡去除分析標(biāo)記甲J輪廓修改工具看全圖Q圖像工具心缸打印快捷指南段局部放大始d虻文字工裊定量分析快捷指南？n 產(chǎn)拖曳口藁定量工具心7s條帶分析快捷指南二放大并居中卓灰度分析工尾缸克隆計(jì)數(shù)快捷指南」縮小并居中如-W盧泳道分析工具QuantityOne軟件HelpdQuickGuide快捷指南提示如何實(shí)現(xiàn)一個(gè)功能，如定量分析(VolumesQuickGuide),電泳條帶分析(BandAnalysis),差顯分析(DifferentialDisplayAnalysis),克隆計(jì)數(shù)(ColonyCountingAnalysis)等?？旖葜改舷掠?,2,3…步驟，根據(jù)提示完成。使用QuantityOne軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像預(yù)處理、分析、結(jié)果輸出四部分。圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀(GS-800、PharosFX等)或凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等)，圖像預(yù)處理就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進(jìn)行初步處理，以便更好地進(jìn)行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計(jì)數(shù)、差異(聚類)分析等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件的輸出功能，得到我們想要的結(jié)果。QuantityOne軟件提供了多種結(jié)果輸出方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個(gè)思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件。Optin’仁息ImageLaneandBandAna/sisYgn*Anay&iaColoryCouritingReportResufeFig.1-2Qu^TiirtyOne-workflow第二章圖像獲取QuantityOne一版本可以控制Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDocXR、ChemiDocXRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴(kuò)展名1sc的原始圖像文件。下面將具體介紹如何通過QuantityOne軟件從GelDocXR獲取圖像。GelDocXR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡便的儀器，它可以用來拍攝EB、SYBRGreen等染料染的核酸電泳凝膠；SyproRuby、銀染、考馬斯亮藍(lán)等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學(xué)顯色的印記膜等。使用GelDocXR之前，先接通電源，打開位于儀器背面右下角的電源開關(guān)；然后根據(jù)具體的應(yīng)用選擇合適的照明和濾光片位置。原則如下:表格形式模式1.如果樣品是通過EB、SYBRGreen、SyproRuby等染料通過紫外激發(fā)來顯色，就先將樣品置于紫外透射平臺(UVTransilluminator)的中間，關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“TransUV”按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I”處。模式2.如果樣品是通過金屬銀、考馬斯亮藍(lán)等染料染色，就先將白光轉(zhuǎn)換屏(WhiteLightConversionScreen)取下，打開下部的開關(guān)，放在紫外透射平臺上，樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“TransWhite”按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I”處。

模式3.如果是化學(xué)顯色等非透明可見樣品，則用模式2中所示方法，將樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“EpiWhite按鈕”，并將濾光片選擇桿置于位置“O”處。接下來打開QuantityOne軟件，選擇File》GelDocXR，按以下順序操作:EjL*Vii-rLutKimiIttcb 曲曲yiifSr^rtiXLaxiArMtlfrEjL*Vii-rLutKimiIttcb 曲曲yiifSr^rtiXLaxiArMtlfrtQoantiljFOjii*■工5,口(Unffic)①④①按下Live/Focus，成像儀進(jìn)入實(shí)時(shí)成像;②選擇照明模式，一般核酸膠用UV,蛋白膠用White模式；注意，選擇完成后，要按下成像儀面板上相應(yīng)的光源按鈕③此功能有三個(gè)上下鍵按鈕：IRIS（光圈），ZOOM（縮放），F(xiàn)OCUS（聚焦），您可在軟件上直接調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟:調(diào)大IRIS，以看到圖像點(diǎn)ZOOM,將膠適當(dāng)放大調(diào)節(jié)IRIS至合適大?。ㄒ话闱闆r下盡量選擇小光圈，因?yàn)樾」馊吧畲?，圖像更清晰）

d調(diào)節(jié)FOCUS,至圖像最清晰按5>11 四瞥齡必④按"AutoExpose”；如是，單擊AutoExpose,系統(tǒng)將自動(dòng)選擇曝光時(shí)間成像，如不滿意，單擊ManualExpose,并輸入曝光時(shí)間（秒），圖像滿意后保存在自動(dòng)曝光期間，圖象會持續(xù)的輸入到。。口中，直到達(dá)到一定比例的飽和象素值，此比例在5>11 四瞥齡必Click郵AutoExpose；buttoii即明白內(nèi)depressCanseeExposureTimeainonaticailychanging。般C討enu印E序E序Tire■但包可CickonFreezetostoptti-eexposurecrecessFig66Freezingtheexposure一旦圖象質(zhì)量達(dá)到要求，點(diǎn)擊Freezebutton來終止曝光。⑤如是蛋白凝膠，接第6步直接將清晰的圖像保存即可⑦按下“Analyze”；這將會打開一個(gè)新的窗口來顯示捕獲的圖象，該圖象具有默認(rèn)名稱，具有日期、時(shí)間及用戶名（如果已知的話）等信息。⑧按下“Save”鍵，保存圖像。第三章圖像分析QuantityOne的圖像分析功能相當(dāng)強(qiáng)大，根據(jù)不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性分析以及克隆計(jì)數(shù)（用于藍(lán)白斑篩選）等等，而且每種分析法都有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和輸出方式。本章重點(diǎn)介紹常用的定量分析和條帶分析方法，其余更細(xì)更深的功能請參考軟件自帶的用戶手冊。

一?定量分析(VolumnAnalysis)定量分析是計(jì)算選定區(qū)域內(nèi)信號強(qiáng)度的總和，是QuantityOne最方便的定量工具。這種分析方式考慮選定區(qū)域的真實(shí)形狀，可用于電泳條帶、斑點(diǎn)、大型芯片等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景,可以按照用戶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出條帶或斑點(diǎn)的濃度，但它不能計(jì)算分子量，也不能進(jìn)行條帶匹配和相似性分析。QuantityOne軟件稱這類定量的結(jié)果為Volume。V。lume=選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號強(qiáng)度的總和X像素面積Volume的單位：intXmm2快捷指南VolumesQuickGuide,能夠指導(dǎo)您對任意所選區(qū)域進(jìn)行定量分析，此分析可以報(bào)告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對濃度和絕對濃度（須提供標(biāo)準(zhǔn)品）。具體的操作方法如下：SelectScanrw..口即eSwmfaxWoiumBFiseTodVoIuitbQwriourloolWoiumBFiseTodVoIuitbQwriourloolSelectTool0.PltMlImaper...祿目.炳加nr?Am刎isRtpoit.KGoriwnwi^■□ri-clicfc=copj/avchmebou.q卜nrotateavolurnebo^.選擇成像系統(tǒng)或打開已保存的文件（軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff[1]文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理）.ZoomBox,縮放，對圖象進(jìn)行放大觀察.Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對比度黑白.選擇待分析區(qū)域：VolumnContourTool等高線勾勒區(qū)域，自動(dòng)連接濃度相同的點(diǎn)，如U1VolumeFreehandTool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)則形狀，如U2VolumeRectTool矩形區(qū)域選擇，如U3

VolumnCircleTool圓形選擇區(qū)域，如U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。.雙擊所選區(qū)域，出現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn（U1,U2…即待計(jì)算樣品），背景Background（B1,B2…，軟件在算濃度時(shí)會將此區(qū)域的濃度自動(dòng)扣除）或標(biāo)準(zhǔn)樣品Standard（Std1,Std2,如果該樣品是濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentration一欄輸入該樣品的濃度）。

SelectTool選擇不同區(qū)域PrintImage打印圖像VolumeAnalysisReport定量報(bào)告結(jié)果，打開出現(xiàn)如下窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，主要有2個(gè)參數(shù)Volume、adj.Vol.即adjustedvolume）和Concentration。Volume為定量值,adj.Vol.為扣除背景后的定量值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品（Std）,軟件可報(bào)告Concentration絕對濃度。參數(shù)選好后，按下按鈕"done"。

軟件報(bào)告如下圖所示：按右側(cè)輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報(bào)告打印出來。Gelnama■CntoriQji?(Raw1-D版剪磨)IndexMaiTmValurrtfiDD*fl*rri2二一二IndexMaiTmValurrtfiDD*fl*rri2二一二r二二E?_1UIJ.43507097621123.72Se99i173.2d15B9E103UG2004334312t8099帕7754LH17S88S287714281720775Bt0)897053590,000000000BackgjaundSubtradionM^lhod.GlobaldataunitnOpticaldensity(OD) ScreenPage\打印“、 ，一文本輸出A\狗引M一謔】 上I回畫用二.條帶分析(BandAnalysis)條帶分析是QuantityOne最基本的分析工具，它可以自動(dòng)識別電泳泳道和識別條帶，依據(jù)泳道的平均光密度和條帶寬度對每個(gè)條帶進(jìn)行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣可以實(shí)現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀因素而進(jìn)行全自動(dòng)定量。用條帶分析的方法進(jìn)行定量的結(jié)果叫TraceQuantity(TraceQty),計(jì)算方法是：首先軟件自動(dòng)計(jì)算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個(gè)具體條帶的定量值是平均光密度曲線的線下面積的積分，即：TraceQuantity=平均光密度X條帶上下邊界的距離TraceQuantity的單位：OD*mm10Lan.&Sampling冉MtnrLTuinruiwTBandN軟號pixelintensityAy白的自由int6hSityrntegrat^un-dercurveto值隨liiwforuandquanthation(.intensityxmm).|PeakBandProfile條帶分析中的條帶定量題^下面介紹用此功能對泳道內(nèi)的所有條帶進(jìn)行分子量確定，相對濃度分析11口陽…E.Zoqiti日口x3Itansforrn.FiameL凸hes__-S.ShetehFrame：6.Add/AdiustAnchws?Lan日Backgraund.白。已修出Bands^..9Standards...10.Attributes.11Match12PiiniImage...13-AHLdnefRejMtl打開已保存的文件（如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff[1]文件格式,軟件也可進(jìn)行分析處理）.ZoomBox，縮放，對圖象進(jìn)行放大觀察.Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對比度黑白.確定泳道（lane）,并對泳道進(jìn)行各種調(diào)整（實(shí)際實(shí)驗(yàn)中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形）。按下圖所示在軟件的工具欄中有一LaneTool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。12AvtoFrji?LvimFruwlanB。-.SnetdiFiarte島制總部I叼牝k曲fFReiHJvtAndiaiAvtoFrji?LvimFruwlanB。-.SnetdiFiarte島制總部I叼牝k曲fFReiHJvtAndiai匚rfrMeLaxAdjustlaneUrkadfjslLaneRawvtLa?Lane-WdtJi...LancGdchgrcund.PMLwb年14b41KLaneToo1+j泳道編輯工具鈍口為回圃圜畫E￥l±lJd刈llsdsl。事G?Ie出andAcfriaE如RbiwjybBardHctBandRandshiLaneBandAltfttpuer?_TzjXIBandTogL+j條帶編輯工具包小?IM??耳?L二二二一十一十二.選擇Frame1_2加$,輸入圖像實(shí)際泳道（lane）數(shù)并確認(rèn)。此時(shí)圖像上泳道的位置上會出現(xiàn)一條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。.選擇Add/AdjustAnchors,此時(shí)泳道紅線上會出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(diǎn)（anchor）,錨定點(diǎn)規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時(shí)，點(diǎn)擊出現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點(diǎn)。鼠標(biāo)按住錨定點(diǎn),可以拖動(dòng)錨定點(diǎn)，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。.LaneBackground去除泳道背景。點(diǎn)擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c(diǎn)擊之，然后在彈出的對話框中選"AllLaneOn"，在"RollingDiskSize”中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值［1］。.DetectBand,檢測泳道內(nèi)的條帶，打開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity靈敏度可調(diào)節(jié)檢測出的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)LaneWidth使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。打開工具欄中BandTool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具（如上圖）13

9?LecIBuJx-Pr4-teinx曲小西寺MNjcm「IwdSgsrti|Delrtt|Re=sH|rowrowOei?dr-NmuiOei?dr-Nmui人工編輯按鈕￥MannafceffY?「MiGhodvw;rAepdPAwepi±l±l*l*l*l+l圖*]*]tltl包bfrLKlICfeM?I〃/人工編輯按鈕￥MannafceffY?「MiGhodvw;rAepdPAwepi±l±l*l*l*l+l圖*]*]tltl包bfrLKlICfeM?I〃/9.Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入^叩Standard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW（蛋白質(zhì)）還是BP（核酸）等（左下圖）。在Protein-Standard對話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)（右下圖），回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動(dòng)將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對應(yīng)。SelectLlrJsB立苜士 - AscertdlngIsoel?cticic Faint - AscendingPoin-t - 0甘呂sendingHaleCUlai MeigG - Ascertdiri'yMbEmaliZE七RE - 2E由|Hew]賦值圖標(biāo)二」告訴蟀麻朗14』留回匚朗cel|BandAttribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動(dòng)計(jì)算出了其他未知條帶的分子量,打開bandattribute選擇要報(bào)告的參數(shù)，這里我們選擇MolecularWeight，圖象上可以看到所有條帶的分子量（紅顏色標(biāo)記），標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。nvadltoddER4r戶I&HHj4tBukuGW方AwnnvadltoddER4r戶I&HHj4tBukuGW方Awnbji"frerM^F￡h?pgLiwI■M9蟲寸,可引號-57|寸105rlVJMKn”引、EB魚圉01直印0|畫?1到國其490PrintImage打印圖象AllLaneReport所有泳道條帶結(jié)果報(bào)告。打開窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，如.（分子量，如左下圖），軟件將報(bào)告結(jié)果