內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在化膿性腦膜炎時(shí)的表達(dá)及意義

內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在化膿性腦膜炎時(shí)的表達(dá)及意義

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（cnf）是神經(jīng)養(yǎng)分家族的第二個(gè)成員。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，它對(duì)各種神經(jīng)元的分配、分化、生存和損害后的再生起著重要作用。近年來(lái)，nbf與免疫系統(tǒng)和內(nèi)政部系統(tǒng)之間的關(guān)系也得到了關(guān)注，但理解仍然很少。地塞米松(DEX)被提倡使用于化膿性腦膜炎(化腦)作為抗炎治療,但它是否能改善化腦的死亡率和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥尚有爭(zhēng)議,回顧性調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)它能減少肺炎鏈球菌腦膜炎死亡率和聽(tīng)力障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。在化腦時(shí)DEX是否能調(diào)節(jié)內(nèi)源性BDNF表達(dá),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚。我們通過(guò)化腦模型加用DEX治療,以觀察其神經(jīng)保護(hù)作用。免疫組化染色采用肺炎鏈球菌Ⅲ型菌株(31003_16),在37°C5%CO2環(huán)境中于VITALAER肉湯里生長(zhǎng)過(guò)夜,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期收菌,用生理鹽水沖洗2次,再稀釋成每ml107克隆形成單位(colonyformingunits,cfu)。采用3周齡SD大鼠30只,雌雄不限,取自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。用10%水合氯醛(0.15~0.3ml/100g體重)腹腔注射麻醉大鼠后,固定于立體定位儀。腦膜炎的誘導(dǎo)按Diab報(bào)道進(jìn)行,腦池穿刺,移去50μl腦脊液,注入肺炎鏈球菌懸液50μl。接種后24h,取腦脊液50μl檢查,計(jì)白細(xì)胞總數(shù),結(jié)果感染后較感染前明顯升高,并以中性粒細(xì)胞為主。腦脊液感染前培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),感染后培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成3組,各組10只。(1)感染后24h組:感染后24h不做任何處理即處死。(2)抗生素治療組:感染后24h給予頭孢曲松皮下注射,共3天,于第5天處死。(3)抗生素加DEX治療組:感染后24h給予頭孢曲松皮下注射+DEX3mg/(kg·d)腹腔內(nèi)注射,共3天,于第5天處死。3組大鼠都經(jīng)主動(dòng)脈灌流生理鹽水及4%多聚甲醛,剝離組織,再浸入4%多聚甲醛4°C后固定4h,移入30%的蔗糖溶液過(guò)夜。經(jīng)海馬冠狀面冷凍切片,厚30μm。免疫組化二步法染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司,二步法染色按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。兔抗大鼠多克隆抗體BDNF是美國(guó)Chemicon產(chǎn)品,購(gòu)自晶美生物工程有限公司。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果,經(jīng)計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)圖象掃描分析,每個(gè)切片取10個(gè)高倍鏡視野,測(cè)量每個(gè)視野陽(yáng)性面積比。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,采用方差分析,當(dāng)差異有顯著意義時(shí),行兩兩q檢驗(yàn),P<0.05為顯著界值。軟側(cè)腦室、腦室及腦實(shí)質(zhì)炎性滲漏感染后24h大鼠均有明顯的臨床表現(xiàn),經(jīng)敏感的抗生素或抗生素加DEX治療后癥狀緩解,兩組之間差異無(wú)顯著性。見(jiàn)表1。免疫組化染色結(jié)果顯示,感染后24h組BDNF蛋白在腦組織廣泛區(qū)域表達(dá),在軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔、腦室及腦實(shí)質(zhì)炎性病灶內(nèi),滲出炎性細(xì)胞有BDNF蛋白高表達(dá);抗生素治療組BDNF蛋白在腦組織表達(dá)稀少,多數(shù)區(qū)域無(wú)陽(yáng)性染色顆粒,僅在少部分皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)極少量密集的陽(yáng)性染色顆粒,與感染后24h組相比差異有顯著性(P<0.01);抗生素加DEX治療組BDNF蛋白在海馬表達(dá)明顯,皮層表達(dá)在抗生素組區(qū)域的基礎(chǔ)上廣泛增加,與抗生素治療組比較差異有顯著性(P<0.01),但仍未達(dá)到感染后24h組的水平(P<0.05)。治療后兩組軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔、腦室及腦實(shí)質(zhì)炎性病灶內(nèi)炎性滲出已不明顯。陰性對(duì)照未見(jiàn)免疫組化陽(yáng)性染色顆粒。dex對(duì)腦損傷的保護(hù)作用化腦致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要是由于宿主的炎癥反應(yīng),在使用敏感抗生素后,細(xì)菌成分釋放到腦脊液增加毒性炎癥反應(yīng),引起一系列的病理生理變化,由此,臨床上提倡加用DEX與抗生素聯(lián)合應(yīng)用治療化腦。至今DEX是否能減少化腦的死亡率和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥尚有爭(zhēng)議。Shembesh等報(bào)道DEX能改善化腦的急性炎癥反應(yīng)和縮短發(fā)熱時(shí)間,而不影響死亡率和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生?；仡櫺哉{(diào)查發(fā)現(xiàn)DEX輔助治療可明顯減少肺炎鏈球菌腦膜炎的死亡率和后遺癥。一些臨床觀察也發(fā)現(xiàn)DEX與抗生素并用可減少聽(tīng)力障礙,尤其是感音性聽(tīng)力下降等后遺癥的發(fā)生。Jamie等實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),DEX輔助治療減少或防止感音性耳聾發(fā)生,改善聽(tīng)閾值,特別是在病程的早期效果顯著。然而,至今仍缺少?gòu)姆肿铀教接懫浔Ｗo(hù)化腦腦損傷直接證據(jù)的報(bào)道。我們的研究結(jié)果顯示,感染后24h,在腦組織和滲出的炎癥細(xì)胞均有高水平表達(dá)的BDNF蛋白,抗生素治療后,腦組織BDNF蛋白表達(dá)降到很低水平;DEX輔助治療后能明顯地增加BDNF蛋白在腦組織的表達(dá),但沒(méi)有達(dá)到治療前水平。這一研究結(jié)果表明,感染后24h,腦組織和炎癥細(xì)胞所呈現(xiàn)的內(nèi)源性BDNF表達(dá)增加,能起到一定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。單獨(dú)使用抗生素治療后,BDNF蛋白的合成可能受到某種影響,而DEX在一定程度上可能阻止了這一影響過(guò)程。用抗生素治療化腦時(shí),產(chǎn)生大量的細(xì)菌產(chǎn)物刺激腦細(xì)胞和炎癥細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子和炎癥因子。其中腫瘤壞死因子(TNF_α)和白介素1(IL_1)作為先驅(qū)因子協(xié)同觸發(fā)一系列的炎癥介質(zhì)。研究表明,IL_1和TNF_α可減低BDNFmRNA表達(dá)。單獨(dú)使用抗生素治療后這些細(xì)胞因子有可能抑制BDNFmRNA的表達(dá),而使BDNF處于較低的水平。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),DEX可抑制IL_1和TNF_αmRNA表達(dá)。已有的研究證實(shí),BDNF具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用,在各種腦損傷時(shí),BDNF表達(dá)增加并能抵御損傷所致的神經(jīng)元死亡。腦缺氧缺血后,腦內(nèi)廣泛區(qū)域尤在海馬出現(xiàn)BDNF表達(dá)明顯增加,呈現(xiàn)抵御缺氧缺血致腦損傷的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用,腦室內(nèi)注射外源性BDNF治療缺氧缺血所致腦損傷,可明顯縮小腦梗死灶以及增加存活神經(jīng)元的數(shù)量,抑制細(xì)胞凋亡,恢復(fù)記憶功能,尤其是對(duì)發(fā)育早期的缺氧缺血腦損害其作用更突出[10~12]。當(dāng)聽(tīng)神經(jīng)和毛細(xì)胞受損時(shí),BDNF能提高和保護(hù)聽(tīng)神經(jīng)細(xì)胞的存活并誘使之再