腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在細(xì)菌性腦膜炎炎癥細(xì)胞中的表達(dá)

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在細(xì)菌性腦膜炎炎癥細(xì)胞中的表達(dá)

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（nbu）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要作用，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)的生存、生殖、成熟和再生。它也是維持神經(jīng)系統(tǒng)存活和正常生理功能的必要因素，以促進(jìn)神經(jīng)損傷后的再生。BDNF的最適配體為TrkB受體,BDNF與TrkB受體結(jié)合并激活酪氨酸激酶,從而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。BDNF對免疫的調(diào)節(jié)作用日益受到關(guān)注,在炎癥損傷情況下,僅偶有報(bào)道散發(fā)性腦白質(zhì)病變和多發(fā)性硬化患者腦組織內(nèi)滲出的炎癥細(xì)胞有高表達(dá)的BDNF,然而BDNF和TrkB在細(xì)菌性腦膜炎滲出的炎癥細(xì)胞中的表達(dá)尚不清楚。本研究通過建立3周齡大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型,探討B(tài)DNF和受體TrkB在幼年大鼠細(xì)菌性腦膜炎炎癥細(xì)胞中的表達(dá),這對于深入研究BDNF在急性細(xì)菌性腦膜炎時的免疫作用有著十分重要的意義。1材料和方法1.1cif/l肺炎鏈球菌Ⅲ型菌株(31003-16)購自北京中國藥品生物制品鑒定所,接種于血瓊脂糖培養(yǎng)液,在37℃5%CO2環(huán)境中生長過夜,再移種于VITALAER肉湯里,生長至對數(shù)生長中期收菌,用生理鹽水沖洗2次,再稀釋成1010cfu/L。1.2肺炎球形細(xì)菌感染大鼠wbc后分離培養(yǎng)取自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心3周齡SD大鼠16只,雌雄不限。隨機(jī)分成兩組,感染組10只,對照組6只。用10%水合氯醛0.15~0.3ml/100g體質(zhì)量靜脈注射麻醉后,固定于立體定位儀。腦膜炎的誘導(dǎo)參照李玲等方法,腦池穿刺,移去50μl腦脊液,感染組注入肺炎鏈球菌菌懸液50μl,對照組注射生理鹽水50μl。置籠中于室溫23℃,明暗各12h,自由飲食。接種后24h,取腦脊液50μl計(jì)數(shù)白細(xì)胞(WBC)。感染組大鼠感染前腦脊液WBC為(54.06±37.09)×106/L,主要為淋巴細(xì)胞,感染后為(4321.24±1230.72)×106/L,主要為中性粒細(xì)胞,WBC感染后較感染前明顯升高(F=84.96,P<0.01)。對照組大鼠腦脊液WBC注射前(53.76±32.19)×106/L,注射后(56.01±35.37)×106/L,均以淋巴細(xì)胞為主,注射前后無明顯變化(F=0.09,P>0.05)。感染組大鼠感染前腦脊液培養(yǎng)無細(xì)菌生長,感染后腦脊液培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌。對照組大鼠注射前后腦脊液培養(yǎng)均無細(xì)菌生長。1.3海馬冠狀面冷凍切片兩組大鼠經(jīng)主動脈灌流0.1MPBS及4%多聚甲醛,剝離腦組織,再浸入4%多聚甲醛4℃后固定4h,移入30%蔗糖溶液中直至組織塊沉下,速凍,經(jīng)海馬冠狀面冷凍切片,免疫組化30μm,原位雜交15μm,貼于經(jīng)賴氨酸預(yù)處理的玻片,吹干。1.4晶美生物工程有限公司兔抗大鼠單克隆抗體BDNF(美國Chemicon產(chǎn)品)購自晶美生物工程有限公司。免疫組化二步法染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,二步法染色按試劑盒說明進(jìn)行。用PBS替代特異性抗-BDNF抗體作為陰性對照。1.5檢測試劑盒BDNF及其受體TrkB地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針和原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,原位雜交檢測按試劑盒說明進(jìn)行。用PBS代替探針做雜交陰性反應(yīng)對照。2結(jié)果2.1叛亂分子的出現(xiàn)感染后24h大鼠軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下隙及腦室內(nèi)滲出的炎性細(xì)胞可見BDNFmRNA陽性雜交信號(圖1),對照組未見炎性滲出(圖2)。2.2cnf蛋白在炎癥細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)感染后24h大鼠軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下隙、腦室內(nèi)滲出的炎性細(xì)胞均有較強(qiáng)的陽性染色顆粒(圖3)。對照組未見炎性滲出。2.3trb受體mrna對炎癥細(xì)胞的表達(dá)感染后24h大鼠軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下隙、腦室內(nèi)滲出的炎性細(xì)胞可見TrkBmRNA陽性雜交信號(圖4),對照組未見炎性滲出。3細(xì)菌fig和trkb的相互作用BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一,對神經(jīng)元的可塑性、存活以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和樹突的生長發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在各種病理損傷狀態(tài)下,BDNF能夠防治神經(jīng)軸索的損傷,這些作用影響著關(guān)鍵神經(jīng)元的數(shù)量,包括感覺、小腦和脊髓神經(jīng)元等。BDNF通過結(jié)合表達(dá)在神經(jīng)元上的高親和力受體TrkB發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),BDNF也通過結(jié)合截?cái)嘈蚑rkB受體調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。BDNF主要來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元,全長型TrkB受體僅表達(dá)在神經(jīng)元上。細(xì)菌性腦膜炎時,除神經(jīng)元表達(dá)BDNF蛋白、BDNF和TrkB基因外,蛛網(wǎng)膜下隙、腦室內(nèi)滲出的炎癥細(xì)胞不僅高表達(dá)BDNF蛋白、BDNF基因,而且同時表達(dá)TrkB基因。這一結(jié)果提示,炎癥細(xì)胞表達(dá)BDNF及BDNF和TrkB基因可能是對細(xì)菌侵入的反應(yīng),炎癥滲出既可由BDNF介導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,同時炎癥細(xì)胞也是BDNF的靶細(xì)胞,在細(xì)菌性腦膜炎時,BDNF可能參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),進(jìn)一步證實(shí),BDNF同時作用于神經(jīng)系統(tǒng)以外的免疫組織。已有的研究認(rèn)為,在細(xì)菌性腦膜炎形成過程中,細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下隙后,刺激中樞免疫細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子和炎癥前分子,形成一個復(fù)雜的炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素1(IL-1)作為先驅(qū)因子協(xié)同觸發(fā)一系列的炎癥遞質(zhì),包括IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細(xì)胞因子,化學(xué)因子,血小板活化因子,前列腺素,基質(zhì)金屬蛋白激酶等,這些炎癥遞質(zhì)在細(xì)菌性腦膜炎病理生理的發(fā)展以及腦損傷的形成過程中都發(fā)揮了各自重要的作用,并相互影響,這一炎癥反應(yīng)決定著細(xì)菌性腦膜炎的預(yù)后。由此,一直以來采用減輕炎癥反應(yīng)的治療策略來防治細(xì)菌性腦膜炎的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,盡管新的強(qiáng)有力的抗生素不斷問世和應(yīng)用,但近十年來,細(xì)菌性腦膜炎神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率仍居高不下。我們先前的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌腦膜炎動物經(jīng)抗生素治療后BDNF表達(dá)明顯降低,皮層、海馬存活神經(jīng)元明顯減少,補(bǔ)充外源性BDNF輔佐治療后,皮層、海馬存活神經(jīng)元數(shù)明顯增多。這些研究結(jié)果表明,在細(xì)菌性腦膜炎時,炎癥細(xì)胞表達(dá)BDNF,證實(shí)炎癥反應(yīng)和炎癥細(xì)胞滲出不僅是有害的,也是有利的,神經(jīng)營養(yǎng)因子與TNF-α、IL-1β等炎癥遞質(zhì)可能是細(xì)菌性腦膜炎炎癥反應(yīng)過程中,既有保護(hù)又有破壞作用的兩個系統(tǒng),共同影響著病情發(fā)展的勢態(tài)。對于免疫細(xì)胞是否表達(dá)TrkB受體,國際上還有爭議。有研究報(bào)道,在人和鼠淋巴組織和免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TrkB受體。一些體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)人B和T細(xì)胞中表達(dá)TrkBmRNA及其蛋白,但也有研究報(bào)道,在體外培養(yǎng)的T細(xì)胞和多發(fā)性硬化活檢腦組織里未發(fā)現(xiàn)TrkB的表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí),細(xì)菌性腦膜炎時,滲出的炎癥細(xì)胞不僅表達(dá)BDNF基因及其蛋白,還同時表達(dá)TrkB受體,提示炎癥細(xì)胞也是BDNF的靶器官,BDNF對炎癥細(xì)胞的功能究竟有什么樣的作用,BDNF如何通過TrkB介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫功能或免疫反應(yīng)尚不清楚