小柴胡湯對lps誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠模型體溫及血清il-1、il-6、nf-的影響

小柴胡湯對lps誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠模型體溫及血清il-1、il-6、nf-的影響

柴胡湯主要用于治療發(fā)熱綜合征，但從原始柴胡湯的角度來看，柴胡的劑量是一半，劑量遠(yuǎn)高于黃甘草和生姜的劑量（各3種）。根據(jù)文獻(xiàn)報道的小柴胡湯，柴胡的絕對劑量和相對劑量低于原處方的劑量。本文通過實(shí)驗(yàn)研究方法，觀察不同柴胡劑量的小柴胡湯對脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型體溫及血清白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6(Interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisfactor-α，TNF-α）的影響，探討小柴胡湯治療發(fā)熱病證的作用機(jī)制，并為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20)g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（渝）2012-0005。1.2實(shí)驗(yàn)用中藥及分組選用的中藥材：北柴胡（傘形科植物BupleurumchinenseDC.的干燥根）、黃芩（唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根）、黨參[桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.的干燥根]、清半夏[天南星科植物半夏Pinelliaternat(Thunb.)Breit.的干燥塊莖與白礬共煮后干燥而成的炮制加工品]、炙甘草（甘草GlycyrrhizauralensiFisch.照蜜炙法加工）、生姜（姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖）、大棗（鼠李科植物棗ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果實(shí)）。以上除生姜購自農(nóng)貿(mào)市場外，其它實(shí)驗(yàn)用中藥均購自同仁堂（貴陽）藥店，所用中藥均由貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥教研室劉芃教授鑒定為正品。不同柴胡劑量的小柴胡湯分3組：小柴胡湯柴胡大劑量組，藥物組成：北柴胡40g、黃芩15g、黨參15g、清半夏15g、炙甘草15g、生姜15g、大棗4枚（約10g）組成。用800mL水浸泡1h，煎煮30min，過濾；再加入800mL，煎煮30min，過濾。合并兩次煎取濾液，再煎取100mL，并將所得藥液用雙層紗布過濾，制作成1.30g·mL-1的藥液；小柴胡湯柴胡中劑量組，藥物組成：北柴胡15g，余藥藥量及煎煮方法同上，制作成1.00g·mL-1的藥液；小柴胡湯柴胡小劑量組，藥物組成：北柴胡6g，余藥藥量及煎煮方法同上，制作成0.91g·mL-1的藥液。3組小柴胡湯水煎液均置4℃貯存冰箱中備用。小柴胡湯方中只有柴胡劑量變化，其余6味藥藥量不變。正常對照組為生理鹽水組。IL-1β、IL-6、TNF-αELISA（美國R&D公司，產(chǎn)品批號：201211）進(jìn)口分裝試劑盒，由昆明綠盟科技有限公司提供。LPS(Escherichcacoliendotox-in055:B5，美國Sigma公司，L2880，批號:1010A031），用無菌生理鹽水溶解成20μg·mL-1溶液。1.3tdl-5測量方法電腦數(shù)字溫度計MC-246型（大連歐姆龍有限公司），探測器：熱敏電阻，測量范圍32～42℃，測量精度：±0.1℃；TDL-5A普通離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；Bio-TEKELX808酶標(biāo)儀（美國BioTeck公司）。2實(shí)驗(yàn)方法2.1大鼠前近代基礎(chǔ)體溫測定70只大鼠在恒溫（20±2）℃、相對濕度50%～60%的實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，每日光照12h，自由取食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，連續(xù)3d早晚測量各組大鼠的肛溫（測溫探頭插入肛門2cm)2次，使大鼠得以適應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前10h禁食不禁水，間隔30min測肛溫2次（2次肛溫波動>0.3℃者剔除），取2次平均值作為大鼠的基礎(chǔ)體溫（T0）。選取體溫合格大鼠50只，并隨機(jī)分為5組：正常對照組、發(fā)熱模型組、小柴胡湯（大）組、小柴胡湯（中）組、小柴胡湯（小）組，每組各10只。2.2中、小中藥水樹立與發(fā)熱模型正常對照組注射同體積生理鹽水，各組動物以20μg·kg-1劑量腹腔注射濃度為20μg·mL-1的LPS生理鹽水溶液；造模同時，給藥組分別灌胃給予相應(yīng)的小柴胡湯水煎液（大、中、小中藥水煎液劑量分別為13g·kg-1、10g·kg-1、9.1g·kg-1），正常對照組與發(fā)熱模型組給予同體積生理鹽水。造模后，每隔30min測定肛溫（Ti），連續(xù)測量240min，計算體溫變化值ΔT（ΔT=Ti-T0）。最后1次測量體溫后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。在5～10min內(nèi)腹主動脈采血5mL。室溫靜置4h左右，4℃離心3000rpm,15min。分離血清，放置-20℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?yán)格按試劑盒內(nèi)操作程序，ELISA法測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。2.3統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS17.0forWindows統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間計量資料相互比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為有顯著性差異。3結(jié)果3.1小柴胡湯對大鼠體溫的影響大鼠在腹腔注射LPS后，與正常組比較，發(fā)熱模型組的體溫呈逐步升高的趨勢，并在3h后出現(xiàn)明顯的發(fā)熱（P<0.01），并持續(xù)至4h。小柴胡湯組（大）組在3～4h此3個時間節(jié)點(diǎn)有明顯降低大鼠體溫的效果（P<0.01或P<0.05），這種降溫效果在3.5h、4h兩個時間節(jié)點(diǎn)優(yōu)于小柴胡湯（中）組、小柴胡湯（?。┙M二組（P<0.01或P<0.05）。具體見表1。3.2組血清中il-6、tnf-的含量比較與發(fā)熱模型組比較，3組小柴胡湯均可明顯降低血清中IL-1β的含量（P<0.05），其中小柴胡湯（大）組降低效果更明顯（P<0.01）；與發(fā)熱模型比較，小柴胡湯（大）組可明顯降低血清中IL-6、TNF-α的含量（P<0.05），顯著降低血清中IL-1β的含量（P<0.01）；與正常對照組比較，小柴胡湯（大）組血清中IL-1β、TNF-α的含量無明顯差異。與發(fā)熱模型比較，小柴胡湯（中）組、小柴胡湯（?。┙M也可降低血清中IL-1β的含量（P<0.05），但3組血清中IL-6、TNF-α的含量差異與發(fā)熱模型組比較并差異不明顯。具體見表2。4補(bǔ)中益氣湯治療lps的作用機(jī)制現(xiàn)代臨床研究證實(shí)，小柴胡湯多用于治療發(fā)熱性病證，其中以感染性發(fā)熱較多，同時對非感染性發(fā)熱和不明原因發(fā)熱也具有較好的效果。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，小柴胡湯對以肺炎鏈球菌為感染源、LPS為發(fā)熱致熱原誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱的抑制效果及對肺炎鏈球菌感染小鼠的保護(hù)作用明顯，發(fā)現(xiàn)小柴胡湯有較好的抗感染及解熱作用。前期的實(shí)驗(yàn)研究報道顯示，LPS按20μg·kg-1劑量腹腔注射，大鼠在注射后2.5～5.5h內(nèi)體溫顯著升高；4h達(dá)峰值（38.5℃），最高增幅為1.15℃。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用20μg·kg-1劑量的LPS腹腔注射制作發(fā)熱模型，并在大鼠注射后4h體溫達(dá)峰值時處死取血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用大劑量的柴胡的小柴胡湯可以降低LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型體溫，效果優(yōu)于中、小柴胡劑量的小柴胡湯。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，引起發(fā)熱反應(yīng)的原因是致熱源作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞等，使之產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，然后經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使產(chǎn)熱增多，促使體溫升高發(fā)熱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用大劑量柴胡的小柴胡湯可降低血清中IL-6、TNF-α含量，顯著降低血清中IL-1β含量，而其余二組小柴胡湯也可明顯降低血清中IL-1β含量，但二組血清中IL-6、TNF-α含量差異與發(fā)熱模型組比較差異并不明顯。因此本研究認(rèn)為，應(yīng)用大劑量的柴胡的小柴胡湯的作用機(jī)制可能與降低血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量等綜合作用有關(guān)。一般認(rèn)為，大劑量柴胡入煎劑12～15g時，可以疏散退熱；中等劑量柴胡入煎劑6～12g時，長于疏肝解郁；小劑量柴胡入煎劑3～6g時，功在升陽舉陷。文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果顯示，臨床上應(yīng)用小柴胡湯治療發(fā)熱柴胡劑量偏大，絕大多數(shù)劑量在10～30g之間，符合傳統(tǒng)的理論認(rèn)識。而柴胡提取液體外抗內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柴胡提取液在較高濃度時對細(xì)菌內(nèi)毒素有較強(qiáng)的破壞作用，但當(dāng)濃度降低時，抗內(nèi)毒素作用明顯減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小柴胡湯可以降低LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型的體溫，柴胡劑量最大的小柴胡湯在LPS體溫達(dá)峰值時，降溫效果優(yōu)于小柴胡湯（中）組、小柴胡湯（?。┙M二組。據(jù)此可以認(rèn)為，小柴胡湯具有降低LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型體溫與降低血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量的功效。在一定的劑量范圍內(nèi)，小柴胡湯的這些功效與柴胡劑量呈正相關(guān)。從藥性理論闡述，