植物乳桿菌對炎癥性腸病腸道菌群紊亂的影響

植物乳桿菌對炎癥性腸病腸道菌群紊亂的影響

感染性腸?。╥bd）主要包括潰瘍性腸病（iuc）和克羅恩?。╟d）。病因不明，目前缺乏有效的治療方法。IBD的發(fā)生和發(fā)展與腸道菌群有著密切的關系,IBD患者表現(xiàn)出明顯的腸道菌群紊亂。益生菌(Probiotics)因其對其他細菌具有明顯的調節(jié)作用和較少毒副作用而逐漸成為IBD治療的新手段,也成為目前研究的熱點,但目前尚缺乏有關益生菌對IBD腸道菌群紊亂調節(jié)作用的研究。本研究將采用可自發(fā)形成類似于人CD病的白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠作為IBD模型,研究植物乳桿菌CGMCC125S(LactobacillusplantarumCGMCC125,LP)對IBD腸道菌群紊亂及細菌移位的影響。1材料和方法1.1白介素10基因缺失小鼠和空白對照小體小鼠il-10-/-LP由上海交大昂立醫(yī)藥研究院提供。該菌最初從嬰兒糞便中分離純化而來,具有良好的益生菌特性。LP以低壓凍干菌粉的形式保存于-20℃以下。菌粉用Ringer緩沖液稀釋后2h內經改良MC培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h,活菌數(shù)達5×1010CFU/g。129品系白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠及空白對照組小鼠均購自美國Jacksonlaboratories公司。本實驗所使用的小鼠均為8周齡雌性小鼠,并以IL-10-/-小鼠作為IBD模型。動物使用許可證號:SYXK(滬)2008-0050。1.2厭氧培養(yǎng)基aRinger緩沖液、TPY基礎培養(yǎng)基和改良MC培養(yǎng)基(上海市疾控中心);N-N瓊脂培養(yǎng)基、MacConkey平板和血瓊脂培養(yǎng)平板(伊華公司);胰化大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基(環(huán)凱生物科技有限公司);厭氧罐和厭氧產氣袋(生物梅里埃公司);MicroscanAutoscan-4細菌鑒定系統(tǒng)和RA-ID板(DadeBehring公司)、SW-CJ超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、DNP-9028恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)、TMQR-3250壓力蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、HHS型恒溫水浴鍋(上海博訊有限公司)、VM-10漩渦振蕩器(上海精科實業(yè)有限公司)、Scientz無菌均質器(寧波新芝生物科技有限公司)等。1.3方法1.3.1檢測linger緩沖液、分光光度法LP菌株于MRS液體培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)12h,5000r/min離心5min后除去上清液,菌體重懸于無菌Ringer緩沖液中,利用分光光度法配制成1.0×109CFU/mL濃度的LP懸液。1.3.2l-10-/-+lp組將8周齡雌性小鼠隨機分成空白對照組、IL-10-/-組和IL-10-/-+LP組,每組5只。IL-10-/-+LP組每日0.5mLLP菌液(1.0×109CFU/mL)灌胃,其余兩組Ringer緩沖液0.5mL灌胃,持續(xù)4周。于實驗開始后第0、2、4周收集小鼠糞便樣本,檢測腸道菌群變化,并于實驗結束后無菌收集小鼠腸系膜淋巴結和脾臟進行細菌移位檢測。1.3.3培養(yǎng)基ld50①Ringer緩沖液:含有半胱氨酸0.25g的Ringer1片(Oxoid),蒸餾水500mL,121℃15min。②MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母粉5g,K2HPO42g,檸檬酸二銨2g,乙酸鈉5g,葡萄糖20g,吐溫801mL,MgSO4.7H2O0.58g,MnSO4.4H200.25g,蒸餾水1000mL,pH6.4。121℃,滅菌15min。③TPY培養(yǎng)基:TPY瓊脂粉末39g,番茄汁400m(自制),蒸餾水600mL,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)0.1g,121℃15min,冷卻至45℃。④改良MC培養(yǎng)基:改良MC瓊脂粉77g,蒸餾水1000mL,吐溫801mL,121℃15min。冷卻至45℃,加入添加劑磷霉素(15.9mg/mL)、磺胺甲氧甲嘧啶(18.6mg/mL)、三甲氧卞氨嘧啶(1mg/mL)各5mL。⑤N-N瓊脂培養(yǎng)基:BactoPetone40g(Difco),Na2HPO45g,Ka2HPO41g,NaCl2g,MgSO40.1g,葡萄糖2g,Bacto瓊脂25g(Difco),蒸餾水1000mL,pH7.6,115℃15min。冷卻至45℃,加蛋黃EggYolkEmulsion100mL(Oxoid)和硫酸新霉素(50mg/mL)4mL。⑥胰化大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA):TSA瓊脂粉末48g,蒸餾水1000mL,pH7.3,121℃15min。1.3.4培養(yǎng)基及微生物培養(yǎng)在無菌條件下收集新鮮小鼠糞便約0.1g,置于4℃Ringer緩沖液中,并在2h內將標本運送至微生物操作室。將標本震蕩混勻后系列稀釋10倍,分別取其適宜稀釋度懸液涂布于TPY培養(yǎng)基(雙歧桿菌)、改良MC(乳酸菌)、N-N培養(yǎng)基(產氣莢膜梭菌)MacConkey培養(yǎng)基(腸桿菌)。除MacConkey培養(yǎng)基37℃、需氧培養(yǎng)24h外,其余各培養(yǎng)基均需37℃、厭氧培養(yǎng)48h。各培養(yǎng)基中細菌菌落需根據(jù)菌落特征、革蘭氏染色和鏡檢初步鑒定后方可計數(shù),并轉換成每克糞便中細菌含量,單位以log,o(CFU/g)表示。無菌采集腸系膜淋巴結及脾臟,勻漿后系列稀釋10倍分別涂布于血瓊脂培養(yǎng)基和胰化大豆瓊脂培養(yǎng)基,在厭氧和需氧條件下37℃培養(yǎng)72h。兩者計數(shù)之和作為腸道細菌移位數(shù)量,結果為每克組織中的細菌含量,單位log10(CFU/g)。1.4統(tǒng)計學處理方法采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計,實驗數(shù)據(jù)以表示,統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(One-wayANOVA),組間比較采用SNK法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1菌株鑒定及鑒定①雙歧桿菌:挑取TPY培養(yǎng)基藍色可疑菌落,在相差顯微鏡下活體觀察。形態(tài)為多形型,菌體呈直、彎、分叉、球拍狀或棒狀(X、V、Y型等),革蘭染色為陽性桿菌。對可疑菌落采用MicroscanAutoscan-4系統(tǒng)和RA-ID板進一步鑒定(圖1)。②乳酸桿菌:挑取改良MC培養(yǎng)基上灰白色中等大小的可疑菌落,在相差顯微鏡下活體觀察,菌體呈桿狀、短鏈狀或柵狀,革蘭染色為陽性桿菌。③產氣莢膜梭菌:在N-N瓊脂培養(yǎng)基上菌落周圍因為卵磷脂酶分解卵磷脂而出現(xiàn)乳白色渾濁圈。本菌為革蘭陽性粗大桿菌,芽孢位于菌體中央或次極端。④腸桿菌:MacConkey平板上生長,菌落濕潤,中等大小,革蘭染色為陰性桿菌。2.2lc對大鼠腸道菌群的調節(jié)作用2.2.1灌胃lp菌液2周后雙歧桿菌含量的變化IL-10-/-組小鼠與空白對照組相比腸道雙歧桿菌含量明顯下降(P<0.05)。IL-10-/-+LP組灌胃LP菌液2周后雙歧桿菌含量上升,但與IL-10-/-組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);灌胃LP菌液4周后雙歧桿菌含量較IL-10-/-組明顯增加(P<0.05),但與空白對照組相比并未恢復至正常水平(P>0.05)(圖2A)。2.2.2il-10-/-+lp對乳酸桿菌含量的影響IL-10-/-組小鼠在干預前腸內乳酸桿菌含量明顯下降。IL-10-/-+LP組灌胃LP菌液2周后乳酸桿菌的含量明顯增加(P<0.05),干預4周后乳酸桿菌含量與空白對照組相比已無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖2B)。2.2.3il-10-/-+lp對產氣莢膜梭菌和腸桿菌的影響在實驗開始時產氣莢膜梭菌和腸桿菌在IL-10-/-組小鼠腸內含量已明顯高于空白對照組(P<0.05),IL-10-/-+LP組灌胃LP菌液2周后盡管并未明顯降低腸桿菌含量,但產氣莢膜梭菌含量則明顯低于IL-1O-/-組(P<0.05),干預4周后產氣莢膜梭菌和腸桿菌的含量均明顯升高,但并未恢復至正常水平(P<0.05)(圖3A、B)。2.3系膜淋巴結和臟器中的位移細菌實驗結束后對照組小鼠并未檢測到腸系膜淋巴結和脾臟細菌移位,而IL-10-/-組小鼠腸系膜淋巴結和脾臟中的移位細菌數(shù)量明顯高于空白對照組(P<0.05)。經連續(xù)4周LP灌胃后,IL-10-/-+LP組小鼠腸系膜淋巴結和脾臟移位細菌的數(shù)量明顯低于IL-10-/-組(P<0.05),但與空白對照組相比仍有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1)。3lp治療粗隆間腸道菌群的作用機制腸道微生態(tài)對維持機體健康狀態(tài)的作用越來越受到人們的關注,甚至有作者將其稱為“被遺忘的器官”。目前已知,腸道微生態(tài)失衡與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展存在密切的相關性,如肥胖、糖尿病、非酒精性肝病和癌癥等,IBD亦位于其列。大量臨床實驗研究亦證實,IBD患者存在不同程度的腸道菌群失調。IBD是一種慢性、復發(fā)性自身免疫性疾病,病因未明,目前普遍認為是遺傳、免疫和環(huán)境因素綜合作用的結果。對IBD的治療尚缺乏有效的手段,目前仍無法治愈,但抗生素治療能明顯減輕腸道炎癥。一些可自發(fā)形成腸炎的實驗動物模型如IL-10-/-小鼠、IL-2-/-小鼠等,在無菌條件下并不發(fā)生腸道炎癥,這些事實都表明腸道菌群在IBD的發(fā)生和發(fā)展中起到了至關重要的作用。近年來,大量的臨床和實驗研究進一步提示,IBD患者腸內菌群調節(jié)將成為IBD治療的新靶向。益生菌被定義為活的、非致病性的微生物,當攝入足夠量時可對機體產生除營養(yǎng)以外的更多有益作用。益生菌可通過多種途徑,比如對腸道菌群的調節(jié)作用來發(fā)揮其對機體健康的有益作用,由此益生菌亦可作為調節(jié)腸道菌群的一種手段來治療與菌群失調有關的諸多疾病,包括IBD。已有研究表明,植物乳桿菌能通過調節(jié)機體免疫反應來減輕IL-10-/-小鼠腸道炎癥,但對如何調節(jié)腸道菌群尚不清楚。本實驗主要研究LP對已建立腸炎的IBD小鼠腸道菌群的調節(jié)作用及細菌移位的影響。在本實驗條件下,IL-10-/-小鼠8周齡即已出現(xiàn)明顯的腸道炎癥,這同Madsen等的研究結果一致。亦有報道腸道菌群的組成具有性別差異,故采用8周齡雌性小鼠作為研究對象。本實驗結果證實,LP能順利通過腸道,耐受體內的酸堿等復雜環(huán)境,具有明顯的益生菌特性,且具有較好的腸道內定植能力。益生菌發(fā)揮其有益作用的確切機制尚不清楚,而且不同菌株具有不同的作用機制。益生菌的作用機制主要包括:對潛在致病菌的競爭性抑制;調節(jié)機體局部和系統(tǒng)免疫反應;增強腸道屏障功能等。既往實驗研究表明,益生菌具有調節(jié)腸道菌群的能力。本實驗研究結果顯示,IL-10-/-小鼠8周齡時即已出現(xiàn)腸道菌群紊亂,被稱為“有益菌”的腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌含量出現(xiàn)了明顯的下降,而潛在的“有害菌”(腸桿菌和產氣莢膜梭菌)含量則出現(xiàn)了顯著的升高,這與IBD患者腸內細菌檢測結果相一致。經連續(xù)4周LP治療后,IL-10-/-+LP組小鼠腸道雙