2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)炎性腸病動(dòng)物模型的建立

2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)炎性腸病動(dòng)物模型的建立

炎癥性腸?。╥bd）是一種病因不明的慢性腸炎病性疾病。由于其惡劣的傾向，它對(duì)患者構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。這是除惡變外，對(duì)胃腸功能中最嚴(yán)重的疾病之一。IBD主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,UC)和克羅恩病(Crohn’sdisease,CD)。其發(fā)病率在歐洲和北美最高,在亞洲等地區(qū)也呈逐年上升的態(tài)勢(shì)。IBD確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚,可能的致病因素包括環(huán)境微生物因素、免疫因素和遺傳因素。目前,通過(guò)外源化學(xué)物刺激誘導(dǎo)腸黏膜產(chǎn)生免疫反應(yīng)來(lái)建立IBD模型是較常用的方法。有研究報(bào)道利用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)誘導(dǎo)的IBD模型與人類(lèi)的CD相似。本研究利用TNBS誘導(dǎo)建立了炎性腸病大鼠模型并對(duì)該模型進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)大鼠的造模和病理切片的制備1.材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性Wistar大白鼠,體重160±20g,購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。TNBS為Sigma公司產(chǎn)品,濃度5%(即50g/L),使用前配制成2.0%TNBS(5%TNBS10ml+無(wú)水乙醇10ml+生理鹽水5ml)。2.方法:將50只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組,TNBS造模組20只,對(duì)照組18只,正常組12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食24h后,用30g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,大鼠用特殊的硅膠導(dǎo)管導(dǎo)入距肛門(mén)約8cm的結(jié)腸內(nèi),TNBS造模組緩慢注入2.0%TNBS,劑量為100mg/kg體重;乙醇對(duì)照組灌注等量50%乙醇,正常對(duì)照組僅灌注等量生理鹽水。在導(dǎo)入藥液的時(shí)候采取頭低尾高的體位,防止灌注液體外溢,并倒提大鼠30s。造模后大鼠平躺,自然清醒,常規(guī)飼養(yǎng)。每天觀(guān)察大鼠的糞便性狀、進(jìn)食情況和精神狀態(tài),并記錄體重和食重。各組大鼠分別于造模后第3、6、14天用戊巴比妥鈉麻醉后處死4只,取病變明顯部位結(jié)腸組織,進(jìn)行病理切片制作,HE染色后顯微鏡下觀(guān)察。3.數(shù)據(jù)處理:數(shù)據(jù)分析結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,所測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析的LSD檢驗(yàn),以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.皮膚正常并無(wú)異常率TNBS造模組大鼠造模后第1天即出現(xiàn)稀便、少動(dòng)、畏寒等癥狀,且大部分稀便帶血,精神狀態(tài)不佳,皮毛也變得粗糙、不光滑,稀便和血便狀況持續(xù)大約8天。造模對(duì)照組中部分大鼠在造模后第1天出現(xiàn)稀便,但第2天即恢復(fù)正常,精神和活動(dòng)狀況正常,皮毛光滑。正常對(duì)照組大鼠未見(jiàn)異常。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,TNBS造模組大鼠造模后共死亡3只,占造模組的15%,其他組均無(wú)死亡發(fā)生。2.大鼠體重至造模前的合成如圖1和圖2所示,TNBS造模組大鼠造模后進(jìn)食量明顯減少,并且體重也持續(xù)下降。造模后第5天食量開(kāi)始有所增加,至第8天達(dá)到造模前食量;體重于造模后第7天開(kāi)始增加,至第10天才恢復(fù)至造模前的水平。造模對(duì)照組大鼠于50%乙醇灌腸后第1天進(jìn)食量有所減少,體重也稍有下降,但第2天即開(kāi)始回復(fù),第3天即達(dá)到并超過(guò)造模前水平。正常對(duì)照組大鼠體重和進(jìn)食量在生理鹽水灌腸后沒(méi)有發(fā)生明顯下降,并于灌腸后第2天超過(guò)造模前水平。3.腸黏膜組織修復(fù)TNBS造模組大鼠造模后第3天結(jié)腸黏膜充血,黏膜上皮中度受損,黏膜下層見(jiàn)大量中性炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腸壁發(fā)生水腫,可見(jiàn)出血病灶,隱窩結(jié)構(gòu)中度受損(封三彩圖7A);第6天可見(jiàn)黏膜糜爛,腸壁壞死并深達(dá)肌層,炎細(xì)性胞浸潤(rùn)腸壁全層,黏膜及腺體脫落形成大面積潰瘍?cè)?腸壁水腫明顯(封三彩圖7B);第14天腸黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)完整,壞死腺體得以修復(fù),腺體數(shù)量較少,腺體間有纖維組織修復(fù)瘢痕,許多腺體內(nèi)可見(jiàn)黏液潴留(封三彩圖7C)。造模對(duì)照組大鼠除僅在第3天鏡下觀(guān)察可見(jiàn)黏膜輕度損傷,腸壁輕度水腫,并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腺體結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,無(wú)出血病灶形成(封三彩圖7D)外,其余時(shí)間觀(guān)察結(jié)果與正常組觀(guān)察結(jié)果基本一致(封三彩圖7E、7F)。tnbs造模的生物學(xué)特性炎性腸病在西方國(guó)家相當(dāng)常見(jiàn),盡管在亞洲國(guó)家的發(fā)病率低于西方,但近10年亦呈上升趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)由于過(guò)去一直認(rèn)為本病少見(jiàn)而重視不夠,但近年據(jù)報(bào)道也已經(jīng)超過(guò)2萬(wàn)人,并且新病例還在不斷發(fā)現(xiàn)。IBD病因和確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚,治療亦頗為棘手。理想的動(dòng)物模型是進(jìn)行病理、病因及相關(guān)治療藥物研究不可缺少的工具。目前,TNBS誘導(dǎo)的大鼠腸損傷模型已廣泛用于人類(lèi)各種腸道病變發(fā)病機(jī)制的研究。TNBS是一種弱有機(jī)酸,屬于半抗原,單獨(dú)在體內(nèi)不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,只有在與組織蛋白等高分子物質(zhì)結(jié)合后才能誘發(fā)免疫反應(yīng),因此造模時(shí)需用乙醇作為腸黏膜屏障的破壞劑,使得TNBS與腸黏膜角蛋白結(jié)合成全抗原,從而激發(fā)局部免疫反應(yīng)。TNBS造成的腸損傷與人類(lèi)的CD在發(fā)病機(jī)制、病理特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)等方面相似,其典型特征是結(jié)腸發(fā)生透壁性壞死和廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并且伴隨著體重的持續(xù)下降。以往有文獻(xiàn)報(bào)道采用較大劑量的TNBS誘導(dǎo)的炎性腸病模型,雖然模型制備成功但病死率較高,約為40%。本研究采用較文獻(xiàn)報(bào)道劑量稍有降低的2%TNBS按100mg/kg體重對(duì)大鼠進(jìn)行灌腸,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到TNBS造模組在造模后體重持續(xù)下降,直至第10天才恢復(fù)至造模前水平,病理切片觀(guān)察在造模后第6天也發(fā)現(xiàn)腸壁壞死并深達(dá)肌層,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腸壁全層,這些都是典型的炎性腸病特征,表明該方法制備炎性腸病模型是成功的,并且采用上述方法造模使模型動(dòng)物的病死率得到顯著控制,為15%。從本實(shí)驗(yàn)造模大鼠結(jié)腸組織的病理變化觀(guān)察中我們發(fā)現(xiàn),TNBS造模后第