中藥復(fù)方體外藥理研究方法與發(fā)展的思考

中藥復(fù)方體外藥理研究方法與發(fā)展的思考

外包藥理學(xué)的研究具有快速、快速、敏感的特點(diǎn)和易控制的優(yōu)點(diǎn)。這在藥物活性篩選、毒性評(píng)價(jià)和細(xì)胞肺癌藥理學(xué)的深入研究中發(fā)揮著重要作用。隨著細(xì)胞生物學(xué)與生化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,體外藥理研究方法日新月異,使得人們能夠更加快速、準(zhǔn)確、深刻地認(rèn)識(shí)藥物的毒理與藥理。復(fù)方研究借鑒現(xiàn)代藥理方法,體外試驗(yàn)日益增多,取得了許多進(jìn)展,如日本小柴胡湯防治肝病的系列藥理研究。但是由于中藥成分復(fù)雜,我國(guó)復(fù)方體外藥理研究基礎(chǔ)較薄弱,需要在實(shí)踐中不斷發(fā)展提高。1測(cè)定復(fù)方中每單味藥的主要成分含量,并研究形成有計(jì)劃有針對(duì)性的藥物研究計(jì)劃慢性肝炎目前尚缺乏特效藥物,日本的慢性肝炎尤其是丙型肝炎發(fā)病較高,在臨床治療中廣泛采用小柴胡湯,療效顯著,一些學(xué)者就其抗肝損傷與抗肝纖維化的作用機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究,近10年來(lái),Medline收錄相關(guān)論文136篇,部分發(fā)表于核心刊物如Hepatology,引起國(guó)際肝病學(xué)界的關(guān)注。這些研究大都采用了體外試驗(yàn),有以下幾個(gè)特點(diǎn)測(cè)定復(fù)方中每單味生藥的主要成分含量,全方質(zhì)控明確;b.全方或單味藥經(jīng)提取制備為藥物粉末,測(cè)定其主要成分含量,并分離可能的數(shù)種主要藥效成分;將全方與單味藥的粗提物、單體成分直接溫育培養(yǎng)細(xì)胞,進(jìn)行全方的量效觀察,以及全方、單味藥與單體成分的藥效比較;c.緊扣疾病病理,闡明主要藥理機(jī)制。如肝纖維化病理關(guān)鍵在于過(guò)氧化等引起的肝星狀細(xì)胞活化。圍繞該病理,發(fā)現(xiàn)小柴胡湯重要作用機(jī)制之一在于抗氧化;d.通過(guò)對(duì)主要藥效指標(biāo)的比較觀察,發(fā)現(xiàn)該方的主要活性成分是黃芩甙與黃芩甙元,這些物質(zhì)與既往所發(fā)現(xiàn)的抗肝纖維化成分-水飛薊素、槲皮素有相似結(jié)構(gòu),均為黃酮類(lèi),提示有可能由此發(fā)現(xiàn)一類(lèi)抗肝纖維化新藥。2測(cè)定藥物成分的檢測(cè)質(zhì)控受試藥物質(zhì)量的穩(wěn)定是藥效穩(wěn)定的前提與基礎(chǔ)。體外試驗(yàn)反應(yīng)靈敏,如果復(fù)方成分含量變化過(guò)大,則藥效重復(fù)性差,難以準(zhǔn)確地反映其藥理機(jī)制,也無(wú)法闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)。受試藥物的質(zhì)控包括藥材與制備工藝兩個(gè)方面。藥材的質(zhì)控內(nèi)容較多,包括種屬、產(chǎn)地、藥用部位、采收加工與鑒定檢查等,其中成分含量測(cè)定是核心。雖然中藥成分繁多,含量低微,檢測(cè)困難,但是這些化學(xué)物質(zhì)成分是決定藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ),體外試驗(yàn)用量少,敏感性強(qiáng),成分含量的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)于體外藥效實(shí)驗(yàn)重復(fù)穩(wěn)定性具有重大意義。盡管難以弄清楚每一種成分,但應(yīng)盡可能對(duì)復(fù)方中各藥物的主要成分建立檢測(cè)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。且制備工藝必須穩(wěn)定,盡量“純化”復(fù)方粗提物,減少雜質(zhì)等的影響。3復(fù)方生物藥理學(xué)檢測(cè)對(duì)于復(fù)方中藥,是粗提物直接添加還是制成含藥血清間接添加,已有報(bào)道。80年代曾見(jiàn)小柴胡湯等方藥的血清藥理研究,可是近來(lái)聲音漸微,但90年代傳入我國(guó)后卻在國(guó)內(nèi)興盛起來(lái),對(duì)方法學(xué)以及采用該方法進(jìn)行藥理學(xué)研究的報(bào)道日漸增多。有的學(xué)者對(duì)此寄予厚望,認(rèn)為不僅可進(jìn)行藥效學(xué)研究,也可進(jìn)行復(fù)方血清藥化學(xué)與藥動(dòng)學(xué)研究,血清藥理學(xué)將成為一門(mén)新型分支學(xué)科。歸納起來(lái),大致認(rèn)為直接添加有三方面缺點(diǎn):a.缺乏復(fù)方的體內(nèi)代謝物或機(jī)體反應(yīng)物等實(shí)際有效成分,引起假陰性;b.機(jī)體非吸收物質(zhì)的體外作用,造成假陽(yáng)性;c.粗提物理化性質(zhì)如雜質(zhì)、酸堿度、滲透壓、pH值等對(duì)離體系的干擾。而含藥血清法具有兩大優(yōu)勢(shì):a.體現(xiàn)復(fù)方藥物的體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化效應(yīng);b.克服藥物本身理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的直接干擾。雖然應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在復(fù)方藥理研究中取得了一些積極進(jìn)展,但是,該方法究竟是不是中藥復(fù)方最佳的體外試驗(yàn)方法,發(fā)展前景如何?這些問(wèn)題尚需進(jìn)一步討論與實(shí)踐發(fā)展的檢驗(yàn)。雖然直接添加法存在諸多缺點(diǎn),但可以較好地控制受試藥物主要成分質(zhì)量,較穩(wěn)定地進(jìn)行藥物量效觀察,較方便地進(jìn)行體外毒理藥理研究易于重復(fù)臨床上中藥多為水煎口服,水溶性物質(zhì)多為主要有效成分,因此離體系統(tǒng)中溶于水的粗提物也是可以反應(yīng)復(fù)方藥效的,而一些理化干擾因素是可以避免的,如雜質(zhì)的去除、酸堿度與滲透壓的調(diào)整等,而且隨超細(xì)粉末等新技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用,粗提物質(zhì)量可進(jìn)一步提高,干擾進(jìn)一步減少。而藥物血清材料可來(lái)自各種不同生理病理狀態(tài)的個(gè)體,會(huì)出現(xiàn)含藥血清差異;而且經(jīng)過(guò)體內(nèi)反應(yīng),藥物含量進(jìn)一步被稀釋,成分更加復(fù)雜,增加了質(zhì)控難度。血清中部分物質(zhì)已是藥物作用機(jī)體細(xì)胞的反應(yīng),如果細(xì)胞存在反饋機(jī)制,血清二次重復(fù)作用于細(xì)胞,將可能掩蓋藥物血清的實(shí)際作用。含藥血清對(duì)離體系統(tǒng)同樣也有干擾,如血清本身對(duì)體外酶活性的影響等。關(guān)于藥物血清添加法與粗提物直接添加的優(yōu)劣比較及與整體藥效學(xué)的相關(guān)性,目前尚無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的研究。藥物血清學(xué)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化也尚未建立,目前還難以確證兩種方法孰優(yōu)孰劣,含藥血清與在體實(shí)驗(yàn)是否有相關(guān)一致。我們及其他一些單位采用兩種添加方法進(jìn)行試驗(yàn),其結(jié)果有相似性。理論上固然可以從有效含藥血清中分離成分,研究復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ),但血清中中藥成分含量低微,加上血清本身干擾,分析難度加大。通過(guò)復(fù)方成分逐步有機(jī)分解結(jié)合藥物篩選,也同樣可以較好闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論何種添加,都只是一種方法,目的在于明確藥物的作用機(jī)制。血清藥理學(xué)有長(zhǎng)處,目前研究較熱,但有局限性,作為一種尚不成熟的實(shí)驗(yàn)方法,還需要發(fā)展完善;直接添加法同樣也能反映藥效,通過(guò)不斷改進(jìn)提取純化技術(shù),可逐步克服自身缺點(diǎn),對(duì)其似乎不宜過(guò)早下否定的結(jié)論。對(duì)兩種方法應(yīng)實(shí)事求是辯證看待,相互補(bǔ)充,共同發(fā)展。4合理選擇測(cè)試對(duì)象和指標(biāo)，并謹(jǐn)慎解釋測(cè)試結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)相比體外試驗(yàn)有其特殊性對(duì)受試對(duì)象多為培養(yǎng)細(xì)胞的離體系而言,以下幾個(gè)方面值得注意。4.1抗肝纖維化用細(xì)胞的研究首先要考慮針對(duì)性與簡(jiǎn)便性。藥理研究當(dāng)然要選擇與疾病發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞,如抗腫瘤藥物選用腫瘤細(xì)胞。但藥物是否對(duì)所選細(xì)胞相對(duì)特異有效?可增加試驗(yàn)細(xì)胞種類(lèi),進(jìn)行比較。細(xì)胞類(lèi)型甚多,實(shí)驗(yàn)難易程度相差很大。對(duì)預(yù)初試驗(yàn)與復(fù)雜條件的摸索,可用性質(zhì)相近來(lái)源方便的細(xì)胞株代替。例如用成纖維細(xì)胞株代替肝星狀細(xì)胞,觀察抗肝纖維化含藥血清的諸多因素影響,建立某些指標(biāo)檢測(cè)方法等。其次要考慮受試細(xì)胞的病理生理狀態(tài),有的細(xì)胞在體外基本是正常生長(zhǎng),不具備病理意義,藥物的作用可能是細(xì)胞毒性。而藥理研究在于觀察藥物對(duì)病理過(guò)程的干預(yù),因此需要造模,在細(xì)胞分離前體內(nèi)或分離后體外予以一定因素誘導(dǎo)。如欲觀察藥物對(duì)肝細(xì)胞損傷的影響,可加四氯化碳或乙醇刺激等。另外要考慮細(xì)胞體外生長(zhǎng)規(guī)律,以確定最佳用藥時(shí)間與細(xì)胞密度。培養(yǎng)細(xì)胞往往有密度抑制的特性,一般藥物作用于指數(shù)分裂期或前期可較好地反映藥效,而控制細(xì)胞密度可滿足不同實(shí)驗(yàn)要求。如細(xì)胞60%～75%融合,可觀察急性毒性,而降低密度并延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間,可觀察慢性毒性影響。4.2復(fù)方毒性測(cè)定化學(xué)成分通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn),估算ID50等數(shù)值,對(duì)評(píng)價(jià)藥物毒性,指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)或臨床用量等有十分重要意義。復(fù)方中藥細(xì)胞毒性怎樣?以含藥血清方式添加會(huì)發(fā)生什么改變?怎樣借鑒化學(xué)成分細(xì)胞毒性研究方法評(píng)價(jià)復(fù)方毒性?尚需探討。細(xì)胞終點(diǎn)毒性指標(biāo)較多,如乳酸脫氫酶活性、[3H]亮氨酸摻入、線粒體MTT轉(zhuǎn)化等,測(cè)定均較簡(jiǎn)便易行。雖然復(fù)方中藥及其含藥血清復(fù)雜,未知因素較多,開(kāi)始較難做到準(zhǔn)確的ID50等測(cè)定,但結(jié)合形態(tài)觀察與生化檢測(cè)對(duì)于大致觀察細(xì)胞毒性及更好了解藥理是有益的。4.3細(xì)胞毒性變化盡量采用新方法與新技術(shù)從細(xì)胞分子乃至基因調(diào)控等水平闡明中藥的作用機(jī)理,是體外實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)與目的。但是中藥的復(fù)雜性可影響敏感的體外藥效的穩(wěn)定性,對(duì)基礎(chǔ)關(guān)鍵性指標(biāo)應(yīng)從多個(gè)方法學(xué)角度觀察并重復(fù)驗(yàn)證,增強(qiáng)可信性。一種細(xì)胞學(xué)生物功能常有多個(gè)反映指標(biāo),例如,對(duì)于細(xì)胞膠原蛋白生成量,通過(guò)細(xì)胞化學(xué)染色與圖像分析可直觀半定量觀察原位沉積,ELISA法可定量分析Ⅰ型等膠原的含量,而通過(guò)同位素標(biāo)記摻入與膠原酶消化可測(cè)定其膠原生成率,這樣綜合不同角度的指標(biāo)可得出較可信的結(jié)論。而一項(xiàng)指標(biāo)可反映細(xì)胞多種功能變化,例如現(xiàn)在多用MTT法所反映的活細(xì)胞數(shù)量來(lái)判斷藥物的增殖影響,但這種細(xì)胞數(shù)量受多種因素影響。如細(xì)胞數(shù)量減少不僅反映增殖抑制,也可能是凋亡或毒性死亡增強(qiáng)。需增加觀察指標(biāo),如[3H]TdR摻入所反映的DNA合成,可解決問(wèn)題。此外體外實(shí)驗(yàn)敏感性強(qiáng),與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有差異。而中藥成分復(fù)雜,影響因素多;受試細(xì)胞不同病理生理狀態(tài)也有不同影響,因此結(jié)論宜慎重,需全面考慮,歸納多方資料而作出。5復(fù)方藥物作用機(jī)制與復(fù)配體系的確定復(fù)雜的中藥復(fù)方理論上可以從不同層次分解為每一清楚的組成部分,即單味藥及其化學(xué)成分,但復(fù)方卻不是這些組成部分的機(jī)械組合,而是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體系。研究發(fā)現(xiàn),全方在成分與藥效上都不等于單味藥的機(jī)械總和。從辯證角度看,作為全方的“整體”與構(gòu)成這個(gè)整體的“部分”—單味藥及其成分是復(fù)方中對(duì)立統(tǒng)一的兩個(gè)方面,符合“系統(tǒng)與要素”的范疇。要素(單味藥及其成分)之間相互聯(lián)系與作用,形成配伍關(guān)系,構(gòu)成系統(tǒng)整體(全方),產(chǎn)生系統(tǒng)質(zhì)。這種系統(tǒng)質(zhì)表現(xiàn)為“結(jié)構(gòu)與性能”兩個(gè)方面,諸要素有機(jī)組成為系統(tǒng)全方的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(物質(zhì)基礎(chǔ)),并決定其外在性能(藥效)表現(xiàn)。因而研究復(fù)方可從系統(tǒng)與要素結(jié)構(gòu)與性能”兩對(duì)范疇中去把握。對(duì)于藥效作用,不能局限于整體復(fù)方,應(yīng)深入分析各種要素的作用及其相互關(guān)系;也不能僅局限于復(fù)方的外部性能認(rèn)識(shí),可結(jié)合組成成分的藥效與成分分析,認(rèn)識(shí)決定這些藥效性能的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ),這樣才能深刻全面地把握復(fù)方藥物的作用機(jī)制。方法上,可以有目的地分離部分主要化學(xué)成分,與全方比較主要藥效作用,從而發(fā)現(xiàn)主要藥效成分,如上所舉的小柴胡湯的研究工作。這種方法目的選擇性較強(qiáng),工作量相對(duì)較小,容易操作;但是忽視了方藥合煎的作用,成分的主觀選擇容易造成遺漏,而且忽視了成分之間的相互作用。另一方法,是以主要藥效指標(biāo)為指引,先復(fù)方正交實(shí)驗(yàn),了解主要藥效藥物及其配伍關(guān)系;而后對(duì)復(fù)方進(jìn)行逐步植化分離,對(duì)每一步分離物都進(jìn)行藥效觀察,追蹤活性部位,逐層深入,可望闡明復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理。這些工作均涉及藥效觀察,藥理模型是其關(guān)鍵,如果采用整體動(dòng)物模型,工作量將十分龐大。因而需要建立合適的體外模型,充分發(fā)揮體外試驗(yàn)周期短、用量少的特點(diǎn),進(jìn)行