新生鼠心肌細胞培養(yǎng)過程技巧方法

一、材料與設(shè)備（一） 實驗動物出生后1-4天SD乳鼠15只。（二） 實驗試劑低糖DMEM、胰酶（含EDTA）、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank,s液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精。培養(yǎng)液：培養(yǎng)液（DMEM，新生牛血清，青鏈霉素）。（三） 器械與儀器鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿（共2套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織）、100ml廣口瓶兩個（分別裝碘酒和酒精棉球）、500ml燒杯、250ml錐形瓶、15ml和50ml的離心管，磁力攪拌器和攪拌子（或者水浴振蕩器）、150-200目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。二、實驗流程（一）實驗步驟將胰酶用D-Hank,s液配成0.06%的濃度，并放置于37°C水浴中溫育好。解剖取材：將乳鼠放入0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's液中。重復(fù)以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。注：為了保證心肌細胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，最好把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺上或者預(yù)冷的平衡鹽液中。用第二套手術(shù)器械進行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預(yù)先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中（或者其它合適容器中，視個人習慣），加少許0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取2-3ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補加胰酶至終體積10ml，加上塞子，放在37C水浴中（可以用一個消毒的500ml燒杯，裝好無菌的蒸餾水，加夠水量，水位線稍低于250ml錐形瓶的刻度線即可，過少則溫度會不均勻，過高容易污染。打開磁力攪拌器電源，預(yù)先將水溫調(diào)節(jié)到37C），調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至60rpm左右，消化15min（務(wù)必保證水浴溫度恒定在37C，并且消化時間不超過15min）。或者，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉(zhuǎn)速和消化時間相同。從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。加入10ml新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機械分散細胞（組織消化后會成為粘稠的膠體狀），注意：不要過分吹打，否則會導致組織過度消化，37°C水浴攪拌再消化10-15min；如果乳鼠數(shù)目少（比如5、6只的時候），消化時間可以減少為5-10min，否則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支50ml的一次性無菌離心管中加入20ml預(yù)冷的含10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，第一次消化收集的分離出的細胞，第一次消化結(jié)束后；繼續(xù)第二次消化，余下的組織塊加入10ml新胰酶繼續(xù)消化。重復(fù)第5步消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化4-5次可以消化絕大多數(shù)的組織塊（不含棄去消化液的那次）。第1、2次含細胞的消化液放在一根離心管中，過180目篩網(wǎng)后，一起離心；第3、4次含細胞的消化液放在一根離心管中，過180目篩網(wǎng)后，一起離心。最后，分別用8ml含20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細胞，接種到一個75cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中1.5小時后，取出，棄貼壁細胞（主要是成纖維細胞和內(nèi)皮細胞），將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5-6X105個/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。一般不用加BrdU，如果培養(yǎng)時間長（發(fā)現(xiàn)成纖維細胞也極少），可以加入0.1mmol/mlBrdU（Sigma）以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU，心肌細胞搏動的持續(xù)時間會更長。接種后24小時，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細胞一次，以去處未貼壁的細胞（部分細胞會在24小時后貼，結(jié)果很多細胞重疊生長），再更換培養(yǎng)液，即可?？梢园凑諏嶒炐枰谂囵B(yǎng)48h或72h后施加處理因素。（二）實驗結(jié)果心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在24h左右基本貼壁，此時細胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好，DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充。鑒定的最簡單的辦法就是搏動與否，注意：當搏動比較微弱的時候，在10倍物鏡下可能看不到搏動，換成20或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的最好的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外，心肌細胞表達肌動蛋白，可以作為鑒定，但不是唯一的特征性指標，因為平滑肌細胞也表達。三、經(jīng)驗總結(jié)（一） 新生大鼠鼠齡的選擇新生大鼠心肌細胞在出生后3d內(nèi)具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌細胞則為終末分化細胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生時間越短，其心肌細胞分離后成活率越高，越容易貼壁生長。大量觀測表明，選擇廣3d齡大鼠分離其心肌細胞進行原代培養(yǎng)較為理想。其中尤以半日齡大鼠心肌細胞培養(yǎng)效果最佳。（二） 消化酶的選擇及使用新生大鼠心肌細胞的分離可采用組織塊法和消化法，前者因不易獲得密度均一的細胞且難控制成纖維細胞的生長而較少采用。消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶I或II以及透明質(zhì)酸酶。透明質(zhì)酸酶多與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用。胰蛋白酶作用較強，容易造成心肌細胞損壞。膠原酶作用較緩和，能消化細胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細胞，對細胞損傷小，且在新生大鼠心肌組織，以膠原I為主，故我們選用膠原酶I。文獻報道膠原酶的工作濃度一般在0.6~1g?L，我們使用的為0.8g?L。膠原酶最好現(xiàn)用現(xiàn)配。（三） 消化程度的把握新生大鼠心肌細胞對酶消化極為敏感。消化過度可使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動能力；消化不足，細胞聚集成團，無法分清細胞邊界，難以形態(tài)學觀測。消化過程中使用磁力攪拌器時應(yīng)注意1）轉(zhuǎn)速一般控制在60~80r?mij左右。（2）每次消化的時間須結(jié)合消化酶濃度確定。（3）將粘附在攪拌子上的心肌組織吹散，使酶液充分接觸組織。（4）適宜溫度為35?37°C。（5）當組織由紅轉(zhuǎn)白呈半透明狀態(tài)時，應(yīng)停止消化。（四） 接種的細胞密度心肌細胞接種密度不僅影響細胞間的相互接觸，進而影響細胞對肥大刺激的反應(yīng)，而且影響長期培養(yǎng)細胞的成活率。接種細胞的絕對數(shù)量應(yīng)經(jīng)精確計算。一般而言，應(yīng)根據(jù)實驗的觀測目的決定單位面積上的細胞數(shù)量。例如，如作形態(tài)學觀測，六孔板中每孔的接種細胞數(shù)量應(yīng)控制在1X105?2X105個；若需收獲心肌細胞作mRNA或蛋白表達水平的觀測，則每孔的接種密度可增加到5X105~6X105個。（五） 細胞的分散度與接種的均勻性分離出的心肌細胞，在溶液中Ca2+作用下較容易出現(xiàn)集聚現(xiàn)象。因此，在進行差速貼壁前后，均應(yīng)反復(fù)多次地輕柔吹打使心肌細胞成單個分散狀態(tài)。接種后，應(yīng)小心使心肌細胞均勻地分布于培養(yǎng)板上，避免細胞向培養(yǎng)孔的中央集聚。此外，可將培養(yǎng)板放入孵箱后用滴管輕輕吹打各孔中央部位2~3次，但應(yīng)格外注意避免污染。（六）對成纖維細胞的抑制與血清種類的選擇成纖維細胞較心肌細胞更容易貼壁且具有分裂增殖能力，經(jīng)差速貼壁后仍有少量成纖維細胞混雜于心肌細胞之中，若處理不當，很容易生長成優(yōu)勢細胞。漠脫氧尿苷（bromodeoxyuridine,BrdU）可干擾細胞的有絲分裂，故常規(guī)使用BrdU抑制成纖維細胞的生長。但是，如果使用胎牛血清培養(yǎng)細胞，由于胎牛血清所含的促細胞有絲分裂的因子較多，BrdU很難完全抑制成纖維細胞的生長。改用小牛血清則可克服這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，獲得高達90%以上的心肌細胞。（七） 換液時間進行心肌細胞形態(tài)學觀測時，接種密度較低，貼壁的心肌細胞數(shù)量減少，為避免成活心肌細胞隨換液而被丟棄，應(yīng)在接種48h后換液。這樣不僅使貼壁的心肌細胞數(shù)量明顯增加，而且BrdU作用時間較長，對成纖維細胞的抑制作用更確實。此外，去血清后可用ITS和0.1g?LBSA對心肌細胞進行營養(yǎng)支持，對心肌細胞貼壁率與凋亡率均不產(chǎn)生明顯影響。（八） 抗污染措施除應(yīng)注意無菌操作等常規(guī)技術(shù)方法外，還應(yīng)特別注意以下幾點：（1）獲取心臟時避免剪破消化道。比較穩(wěn)妥的辦法是在劍突上一肋處入剪，這樣做不涉及腹腔，也就減少了污染機會。（2）如條件允許，應(yīng)避免乳鼠心肌細胞與其他細胞在同一孵箱內(nèi)共同培養(yǎng)，以防止發(fā)生交叉污染。（3）對于培養(yǎng)心肌細胞的觀察、照相每次時間不可過長，否則既會導致培養(yǎng)液pH改變，又能增加污染機率。（九） 培養(yǎng)液pH值