生物分離工程全考點復習資料全套

生物分離工程全考點復習資料全套第一講緒論2學時一、通過本章學習應該掌握的內(nèi)容1、何謂生物分離工程2、生物分離工程的歷史及其應用3、生物分離工程在生物技術中的地位？4、生物分離工程的特點5、生物分離工程可分為幾大部分，分別包括哪些單元操作？6、在設計下游分離過程前，必須考慮哪些問題方能確保我們所設計的工藝過程最為經(jīng)濟、可靠？二、生物分離工程的發(fā)展歷史1、概念：從微生物、動植物細胞及其生物化學產(chǎn)品中提取有用物質的技術2、生物分離工程的發(fā)展歷史已經(jīng)有幾百年的歷史了——最早的分離技術有蒸餾、過濾等原始方法三、ThepositionofBioseparationinBiotechnology（生物分離在生物技術中所占位置）Bybiotechnology,wemeantheuseofcarefullyculturedmicroorganisms,animalcells,andplantcellstoproduceproductsusefultohumans.（所謂生物技術就是指利用培養(yǎng)微生物、動物細胞、植物細胞來生產(chǎn)對人有用的產(chǎn)品。）Bythisdefinition,biotechnologyisasoldashistory,fortheearliestknowndocument(4228BC)includesadescriptionofbrewingBread;cheese,andyogurtareotherearlyexamplesofproductwhichdependonbiotechnology.（按上述定義，早在公元前4228年就有了應用生物技術釀酒、制奶酪等的記載。）Today,werestrictbiotechnologylargelytothoseareaswherechemicallydefinedspeciesareproduced.Underthismorerestricteddefinition,biotechnologyisabout100yearold.（狹義生物技術的產(chǎn)物僅為化學產(chǎn)品，約有100年的歷史。）Effectivewaystogetusefulproducts（獲得產(chǎn)品的有效途徑）（1）Rawmaterials（原料）（2）pretreatments（預處理）（3）bioreactions（生物反應）（4）bioseparations（生物分離）（5）products（產(chǎn)品工程）四、生物分離的應用1、醫(yī)藥：抗生素、激素、維生素2、食品：乳酪3、化工：氨基酸4、精細化工：化妝品、香料5、農(nóng)業(yè)：手性農(nóng)藥6、生物：酶五、生物分離過程的特點1、產(chǎn)品豐富2、Achiefcharacteristicofbiotechnologyisthetremendousvarietyofproductswhichareproduced.

Thisdiversityofproductsspawnsthebroadspectrumofseparationmethodsused.（產(chǎn)品的多樣性導致分離方法的多樣性）2、mostbioseparationmethodscomefromchemicalseparations（絕大多數(shù)生物分離方法來源于化學分離）3、Bioseparationsaremoredifficultthanchemicalseparations.（生物分離一般比化工分離難度大）（1）Complexcomponents（成分復雜）（2）Desiredproductsindilutesuspension（懸液中的目標產(chǎn)物濃度低）青霉素含量為3.6％，慶大霉素為0.2％，胰島素僅為0.001％（3）Biologicalactivity（生物活性）條件相對溫和（4）Biologicalproductsrequirehighquality（生物產(chǎn)品要求高質量）（5）Gethighlypurifieddryproducts（獲得高純度的干燥產(chǎn)品）（6）Sanitation（衛(wèi)生）因此，生物分離過程往往成本很高，在某些產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，分離成本可能占到總成本的80％以上Thustherecoveryandthepurificationprocessesmustbewellconceivedandwelldesigned.（因此必須仔細考慮和設計產(chǎn)品的回收和純化過程）Wehavefoundthatourowndesignshavebeenimprovedbyansweringthefollowingquestions:（設計中應考慮下列問題）（1）Whatisthevalueoftheproduct?（產(chǎn)品價值）（2）Whatisanacceptableproductquality?（產(chǎn)品質量）（3）Whereistheproductineachprocessstream?（產(chǎn)物在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的位置）（4）Wherearetheimpuritiesineachprocessstream?（雜質在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的位置）（5）Whataretheunusualphysicochemicalpropertiesoftheproductandtheprincipalimpurities?（主要雜質獨特的物化性質是什么？）（6）Whataretheeconomicsofvariousalternativeseparations?（不同分離方法的技術經(jīng)濟比較）Carefulconsiderationofthesequestionscanprovidecluesthatwillleadtooptimalprocessesfortherecoveryofproductsofadequatequalitycoupledwithhighrecoveryandminimumeffort.（上述問題的考慮將有助于優(yōu)質、高效產(chǎn)物分離過程的優(yōu)化）六、生物分離的一般步驟Fromourexperience,wefindthatmostbioseparationshavefoursimilarsteps:（生物分離一般分四步）1、不溶物的去除（固液分離）Removalofinsolublesfiltration、centrifugation、celldisruption(necessarywhenthedesiredproductisintracellular.)Relativelylittleproductconcentrationorimprovementofproductqualityoccurs.（提高產(chǎn)物濃度和質量）2、雜質粗分（濃縮）adsorption-ion-exchang（離子交換吸附）extraction（萃?。﹕olventextraction（溶劑萃?。﹔eversedmicelleextraction（反微團萃?。﹕upercriticalfluidextraction（超臨界流體萃?。゛queousphaseextraction（雙水相萃?。㏕hesesteps,whicharerelativelynonspecific,removematerialsofwidelydivergentpropertiescomparedtothedesiredproduct.（以上分離過程不具備特異性，只是進行初分）Appreciableconcentrationandproductqualityincreasesusuallyoccur.（可提高產(chǎn)物濃度和質量）3、純化chromatography（色譜）electrophoresis（電泳）precipitation（沉淀）Theseprocessingtechnologyarehighlyselectivefortheproductandremoveimpuritiesofsimilarchemicalfunctionalityandphysicalproperties.（以上技術具有產(chǎn)物的高選擇性和雜質的去除性）4、精制crystallization（結晶）drying（干燥）七、本章作業(yè)1、生物分離工程在生物技術中的地位？

2、生物分離工程的特點是什么？3、生物分離工程可分為幾大部分，分別包括哪些單元操作？

4、在設計下游分離過程前，必須考慮哪些問題方能確保我們所設計的工藝過程最為經(jīng)濟、可靠？第二講過濾2學時一、通過本章學習應掌握的內(nèi)容1、何謂過濾2、過濾的基本形式3、凝聚和絮凝的區(qū)別4、常用的絮凝劑有哪些5、過濾設備分類6、常用過濾設備及其特點二、過濾的基本概念過濾是在某一支撐物上放過濾介質，注入含固體顆粒的溶液，使液體通過，固體顆粒留下，是固液分離的常用方法之一。Filtrationseparatessolidfromaliquidbyforcingtheliquidthroughasolidsupportorfiltermedium.Thisisastraightforwardprocedureforwelldefinedcrystals.三、過濾前物料的前處理Howeverthesmallsizeofmicroorganismsmakefiltrationoffermentationbeersorotherbiologicalsolutionsconsiderablymorecomplicated.Generally,fermentationbeersandotherbiologicalsolutionsarenotoriouslyhardtofilter.Theyareoftenhardtofilterbecauseofhighnon-Newtonianviscosityorhighlycompressiblecakes.Thatistosay,wemustmodifiedtheseproceduresforbio-separations.通常發(fā)酵液和生物溶液是高粘度的和非牛頓流體，是很難過濾的，為了加快過濾速度，通常可采用以下方法：1、加熱（Heating）——降低液體粘度2、凝聚和絮凝（Coagulationandflocculation）——在電介質作用下，破壞溶質膠體顆粒表面的雙電層，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程四、影響凝聚作用的主要因素Simpleelectrolytesactbyscreeningtheelectrostaticrepulsion,whichcommonlyexistsbetweencolloidalparticles.Whenthiselectrostaticrepulsionisreduced,attractiveLondon-vanderwaalsforcespredominate.Thecolloidscanthencoagulateaslarger,denseparticleswhicharemoreeasilyfiltered.(簡單電解質降低膠體間的排斥力。從而范德華引力起主導作用，聚合成較大的膠粒，粒子的密度越大，越易分離。)1、無機鹽的種類2、無機鹽的化合價3、無機鹽的用量常用的凝聚劑有：Al2(SO4)3.18(H2O)，AlCl3.6(H2O)，F(xiàn)eCl3，ZnSO4，MgCO3五、絮凝作用(Flocculation)概念：指在某些高分子絮凝劑存在下，在懸浮粒子之間發(fā)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團的過程Syntheticpolyelectrolytesaddedaspretreatmentscanbothreduceelectrostaticrepulsionandadsorbonadjacentparticles,formingbridgesbetweenthem.Asaresult,thecolloidalparticlesflocculateaslarge,lessdenseaggregateswhicharemoreeasilyfiltered.Thesepolyelectrolytescanbeanionic,cationicornonionic.（合成助濾劑既降低靜電斥力又吸附周圍的微粒，形成橋架作用。膠粒過大，就發(fā)生絮凝，低密度聚合的膠粒，容易過濾。聚合電解質有陽離子型、陰離子型或非離子型。六、常用的絮凝劑1、天然聚合物多糖類物質、海藻酸鈉、明膠等2、人工合成聚合物聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物、聚丙烯酸類等七、助濾劑1、目的：助濾劑是一種具有特殊性能的細粉或纖維，它能使某些難以過濾的物料變得容易過濾2、常用的助濾劑：硅藻土（Diatomaceousearths）珍珠巖（Perlites）八、GeneralTheoryforFiltrationFluidmechanicsforfiltrationDarcy’slaw（Darcy方程）forincompressiblecake,simplestcase（適用于不可壓縮和簡單的可壓縮濾餅）forcompressiblecake,commonforbio-separations（普遍使用于生物分離過程。）1、Darcy’slaw（達西定律）?V=k△P/μl(2.1)?whereV－velocityoftheliquid?k—proportionalityconstant(usuallycalledtheDarcy’slawpermeabilityofthebed)（K比例常數(shù),過濾床滲透性的達西方程參數(shù)））△P－thepressuredropacrossthebedofthickness（壓降）μ－viscosityoftheliquid（流體粘度）*當Re<5時達西定律才成立?Forbatchfiltrationthevelocityis（板框式過濾流速方程）?V=(1/A)*dV/dt(2.2)A－filtrationarea（過濾面積）V－thetotalvolumeoffiltration（濾液總體積）t－thefiltrationtime（過濾時間）?有l(wèi)/k=Rm+Rc（2.3）Rm——theresistanceofthefiltermediumRM（過濾介質的阻力）Rc——theresistanceofaccumulatecakebio-mass（濾餅的阻力）2、IncompressibleCakes（不可壓縮濾餅）Ifthecakeisincompressible(rigid),thecakethicknessisdirectlyproportionaltothefilterarea.（不可壓縮濾餅厚度正比于過濾的體積）

Asaresultthecake’sresistanceRcisRc=αρo(V/A)(2.4)?whereα－representsthespecificcakeresistance（濾餅的阻力特性）ρo－themassofcakesolidspervolumeoffiltrate（單位體積濾液含固體濾餅量）3、Compressiblecake（可壓縮的濾餅）Almostallcakesformedofbiologicalmaterialsarecompressible,andsocannotbedescribedwiththesimpleequationjustoutlined.Asthesecakescompress,filtrationratesdrop.（大多數(shù)生物濾餅都可壓縮，不能僅用作圖法描述，濾餅可壓縮，則過濾速度降低）?α=α’(△P)s?Whereα’－aconstantrelatedlargelytothesize&shapeoftheparticlesformingthecake.（α’與粒子大小和形狀相關）S－thecakecompressibility（s是壓縮系數(shù)）S=0arigid&highlyincompressiblecake（理想的不可壓縮s=0）S=1ahighlycompressiblecake（高度可壓縮s=1）S=0.1-0.8inpractice（變化范圍從0到1）ValuesofS&α’aremosteasilydeterminedbyplottingthelogarithmofαversusthelogarithmof△Passhowninfig.(2.1)（計算s和α’可用logα對log△P作圖）九、ContinuousRotaryFilter連續(xù)旋轉式過濾機Weanalyzetheoperationoftheseunits,afiltrationcycleonthisfilterconsistsofthreechief（過濾有三步組成）1、cakeformation（濾餅的形成）2、cakewashingtoremoveeitherorunwantedsolutes（濾餅的洗滌）3、cakedischarge（濾餅的卸下）weassumethattheresistanceofthefiltermediumRmisnegligible,sothatwecanuseequation(2.5)（假設濾餅阻力不計），thebasicexpressionforfiltration(1/A)*dV/dt=△P/(μRc)initialconditionthat（初始條件是）t=0v=0Rc=αρo(V/A)=α’ρo(V/A)(△P)stf=(μαρo/(2△P1-s))*(Vf/A)tf——thecakeformationtime（濾餅形成時間）Vf——thevolumeoffiltratecollectedduringthatperiod.（濾液流量）*cakewashing（濾餅的洗滌）作用：（1）First,itdisplaysthesolution-richbrothtrappedinporesinthecake.（將濾餅內(nèi)發(fā)酵液洗出）（2）Second,itallowsdiffusionofsoluteoutofthebiomassinthecake.Suchdiffusionwillenhancerecovery,ifthedesiredproductisinthebiomass.（擴散出生物有機體，這對目標產(chǎn)物在生物有機體很有用）八、過濾設備及其結構過濾設備的分類根據(jù)推動力的不同可分為四類（a）重力過濾自然過濾（b）加壓過濾板框過濾（c）真空過濾真空過濾器（d）離心過濾離心過濾器九、過濾介質1、無定形顆粒：顆粒活性炭、沙、無煙煤2、成形顆粒：燒結金屬、燒結塑料3、非金屬織物：尼龍、玻璃纖維4、金屬織物：不銹鋼絲網(wǎng)5、無紡品：紙、石棉十、典型的過濾設備1、板框壓濾機優(yōu)點：結構簡單、過濾面積大、操作壓力高、適用范圍廣缺點：設備笨重、間歇操作、勞動強度大、輔助時間長2、旋轉過濾機可實現(xiàn)連續(xù)操作十一、本章作業(yè)1、何謂過濾2、過濾的基本形式3、凝聚和絮凝的區(qū)別4、常用的絮凝劑有哪些5、過濾設備分類6、常用過濾設備及其特點第三講離心與沉降2學時一、通過本章學習應該掌握的內(nèi)容1、何謂沉降2、沉降與離心的異同3、沉降與離心的速度方程4、離心設備可分為哪兩大類5、常用的離心沉降設備有哪些6、常用的離心過濾設備有哪些二、離心的概念Thefirststepinmostindustrialbioseparationsistheremovalofinsolublesolidsfromthefermentationbeer.Theconcentrationandsizeoftheseinsolublesvarieswidely.（生物分離首先去除不溶物）Thesizerangesfrommicroorganismsofperhaps1umdiameteruptoinsolublenutrientscharacteristically1mmindiameter（粒徑從1um的到1mm）Whentheseinsolublesaredilute,large&rigid,theycanbeeasilyseparatedbyfiltration.Inthepreviouschapter,wedescribedfiltration,includingtheuseoffilteraids.Formanybeers,thesefilteraidsfacilitatefiltration.Forotherbeers,filteraidsareineffective.（不溶物濃度小，粒徑大，硬度強時用過濾分離。使助濾劑過濾分離，對一些發(fā)酵液很有用）Whenthebeersarenoteasilyfiltered,theysometimescanbeseparatedbycentrifugation,whichisthesubjectofthischapter.（不易過濾可用離心）Centrifugationrequiresmoreexpensiveequipmentthanfiltration.However,itisofteneffectivewayevenwhenthesolidparticlesaresmall&hencehardtofilter.基于固體顆粒和周圍液體密度存在的差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程實際上離心和過濾一樣，也是固液分離的一種單元操作對于一些固體顆粒小、溶液粘度大的生物體系，過濾實際上是很難進行的，必須采用離心技術方能達到目的三、沉降的概念沉降：是指當懸浮液靜置時，密度較大的固體顆粒在重力的作用下逐漸下沉，這一過程成為沉降沉降過程通常是十分緩慢的，對于一些固液密度差異很小的體系沉降往往需要很長時間四、沉降速率方程Whenasolidparticlemovesthroughaninfinitecontinuum,itsvelocityisaffectedbytwoforces.當一固體微粒通過連續(xù)介質時，它的運動速度受到兩種力的作用：1、由于密度差引起的浮力2、微粒受到的流體阻力當浮力與阻力達到平衡時，該微粒以恒定的速度沉降聯(lián)立二式可得沉降速率方程：五、重力沉降式液固分離設備1、特點：設備簡單、運行成本低、能耗低體積龐大、分離效率低2、傳統(tǒng)的沉降設備：（a）矩形水平流動池（b）圓形徑向流動池（c）斜板與斜管式沉淀池六、離心式沉降分離1、分類：（a）離心沉降（b）離心過濾2、離心沉降利用懸浮液或乳濁液中密度不同的組分在離心力場中迅速沉降分層，實現(xiàn)固液分離操作方式：間歇式、連續(xù)式型式：管式、套筒、碟片式（1）管式離心機（Tubularbowl）Simpleyet,canprovideaveryhighcentrifugalforce.（最簡單，可提供較大離心力）Tubularcentrifugescanbecool,arealadvantageinproteinwork.（可用冷卻水冷卻），Suspensionisusuallyfedthroughbottom,andclarifiedliquidisremovedfromthetop.（懸浮液由管底進，澄清液由管口流出）離心過程分析：Tobeginthisanalysis,assumethatthistypicalparticleislocatedat(1)AdistanceZfromthebottomofthecentrifugeasshowinFig3.2.1.(2)Locatedatpositionrfromtheaxisofrotation.（離旋轉軸為r的微粒）(3)ThispositionisbetweentheliquidsurfaceR1&thebowlradiusR0.（位于液體界面半徑r1和管心半徑r0的微粒）TheparticleismovinginboththeZ&rdirections.ItsmovementintheZdirectioncomesfromconvectionofthefeedpumpedinthebottomofthecentrifuge:（Z方向的動力來源于離心機底部泵入料液的對流）dz/dt=Q/[π(R02-R12)](3.8)WhereQisthefeedflow.（料液流速）Theeq(3.8)impliesthatgravityhasonlyanegligibleeffectintheZdirection.（Z方向重力可忽略）WewillassumethatthecentrifugalforceissohighthattheliquidinterfaceR1isconstant,independentofZ.（假定離心力很大，R1是常數(shù)）Theparticlemovementintherdirectionisrelatedtoitsradialpositionrby(3.7).（r方向上運動與半徑r有關）dr/dt=d2(ρs-ρ)rω2/(18μ)(3.9)Wewillrewritethiseq.Intermsofthevelocityofaparticlesettlingundertheinfluenceofgravity:dr/dt=νg(rω2/g)(3.10)WhereνgisvelocitygivenbyEq.(3.6).Wecombine(3.8)&(3.9)tofindthetrajectoryofaparticlewithinthecentrifuge:（得出離心機內(nèi)部微粒的運動軌跡）dr/dz=(dr/dt)/(dz/dt)=νg(rω2/g)π(R02-R12)/Q(3.11)（2）碟片式離心機（Disctypecentrifuge.）dx/dt=ν0-νcsinθ(3.15)ν0=[Q/(2πrln)]f(y)（3.16）nthenumberofdiscs（蝶片數(shù)）rthedistancefromtheaxisofrotation（微粒與轉鼓軸線間距離）lthedistancebetweendisccf(y)somefunctiongivingthevelocityvariationacrossthedistancebetweendiscs.（蝶片間流速變化的函數(shù)）3、離心過濾使懸浮液在離心力場作用下產(chǎn)生的離心力壓力，作用在過濾介質上，使液體通過過濾介質成為濾液，而固體顆粒被截留在過濾介質表面，從而實現(xiàn)固液分離，是離心與過濾單元操作的集成，分離效率更高Thisisthethird,centrifugalfiltration;thebasketunitshowninfig3.2-1d.isreallyacombinationofacentrifuge&afilter.Itconsistsofaperforatedbaskedwhichrotatesrapidly.Suspensionisagainfedalongtheaxisofthebowl&solidaccumulateonthewallofthebasket.WebegintheanalysisbyrecallingthatthepressuredropΔpinaflatcakeisproportionaltothefluidvelocityvthroughthatcake:

(根據(jù)過濾壓差Δp和流體通過濾餅的速度成正比)有：Δp/l=(μαρ0)ν(3.25)Wherelthethicknessofthecake(式中l(wèi)-濾餅的厚度)μthefluidvelocity(u-料液的粘度)αthespecificresistanceofthecake(a－濾餅的比阻力)ρ0themassofsolidpervolumeofliquidfeed(ρ0－單位體積料液所含的濾渣量)-dp/dr=(μαρ0)ν(3.26)2πrlυ=Q(3.27)由（3.26）和（3.27）-dp/dr=μαρ0Q/(2πrl)(3.28)4、常見的離心過濾設備（a）三足式離心機是最常見的過濾式離心機，立式有孔轉鼓懸掛于三根支足上故而得名（b）臥式刮刀離心機可連續(xù)生產(chǎn)，使用效率更高，功率消耗?。╟）螺旋卸料離心機主要用于需耐壓的場合，具較高的分散因數(shù)七、本章作業(yè)1、何謂沉降2、沉降與離心的異同3、沉降與離心的速度方程4、離心設備可分為哪兩大類5、常用的離心沉降設備有哪些6、常用的離心過濾設備有哪些第四講細胞破碎2學時一、通過本章學習應掌握的內(nèi)容1、細胞破碎的意義2、常用的細胞破碎方法3、滲透壓計算方法4、了解機械破碎法所用設備5、滲透壓的計算二、細胞破碎的目的Insomecases,theproductsofinterestarenotinthebrothbutareinthebiomass.Inparticular,mostproteinsproducedinquantitybygeneticallymanipulatedbacteriaarenotexcretedintothebroth,butareprecipitatedwithinthecell.Lipidsandsomeantibioticsarealsotrappedinthebiomass.Inafewcases,likebaker’syeast,thedesiredproductisthecellmassitself.Inafewothers,desiredproductslikesteroidscanbeextractedwithoutrupturingthecells.Inmanycases,theproductistrappedinthebiomass:Itisintracellular.Releasingthistrappedmaterialusuallyinvolvesrupturingthecellwall,andisthesubjectofthisshortchapter.Themethodsofcellrupturehavelargelybeendevelopedinbiochemistry,andhenceareofsmallscale.Theirapplicationtothelargerscaleoperationsimpliedbygeneticengineeringisspeculative.Theequipmentwhichisusedisnotdesignedforbiotechnology.Someequipmentisborrowedfromthedairyindustry,whereitwasdevelopedforthehomogenizationofmilk;otherequipmentistakenfromthepaintindustry,whereitisusedforthesizereductionofpigments.由于有許多生化物質存在于細胞內(nèi)部，必須在純化以前將細胞破碎，使胞內(nèi)物質釋放到液相中，然后方可進行提取三、細胞膜Atthispoint,wepausebrieflytoexplorethephysicalstructureofmicrobialmembranesandthecomplexityoftheproblemswhichweface.Atpresent,knowledgeofthisgeneralstructuredoesnotprovideadirectguidetomethodsofcellrupture.Inthefuture,itmay.Asaresult,wefeelthatasynopsishasmerit.Inthissynopsis,weemphasizeGram-negativeprocaryotes.本節(jié)主要探尋細胞膜的物質結構及我們所面對的幾個復雜問題?，F(xiàn)在所有的關于細胞膜結構的基本知識，并不能為細胞破碎方法提供基本的引導。也許將來可以。正因如此，對此進行提綱切領的介紹很有必要。主要強調的是革蘭氏陰性原核生物。其細胞結構中沒有細胞核：基因物質位于單鏈DNA上。典型的生物是大腸桿菌，是生物技術研究的主體。通過這種細胞生產(chǎn)了很多細胞重組的產(chǎn)物三、細胞破碎的主要方法1、化學法ThechemicalmethodsofcellrupturelistedinTable4.0-1aredominatedbyosmoticshock,detergentso1ubilization,andlipiddissolution.Thesethreemethodsaredescribedinthefollowingparagraphs.Beforethisdescription,wewanttogivesomebriefgeneralizationsabouttheothertwomethods:enzymedigestionandalkalitreatment.滲透沖擊：無論動物還是植物細胞，胞內(nèi)物質都是由膜組織包裹起來的，因此，破壞細胞膜系統(tǒng)是胞內(nèi)物質釋放的關鍵步驟通常細胞膜系統(tǒng)強度較差，易受滲透壓沖擊而破碎Thesimplestofthethreemajorchemicalmethodsisosmoticshock.Thisisnothingmorethandumpingagivenvolumeofcellsintopurewater-oftenabouttwicethevolumeofcells.Thecellsswellbecausetheycontainsoluteswhichcauseanosmoticflowofwaterintothecells.Insomecases,theyswellsomuchthattheyburst.Theircontents,releasedintothesurroundingsolution,cannowbeseparatedusingthemethodsinfollowingchapters.（最簡單的是滲透沖擊法。此法將一定體積的細胞液加到2倍體積的水中，細胞中溶質濃度高，水不斷進入細胞，使細胞膨脹，最后導致破裂。細胞破裂后釋放到周圍環(huán)境中的胞內(nèi)物可用后面章節(jié)介紹的方法分離。）滲透壓的計算方法酶消化：酶法破壞細胞膜系統(tǒng)Thedisadvantageofenzymedigestionisthecostoftheenzymeswhich.Frequentlymakesthismethodprohibitiveatalargescale.Thisisunfortunate,becausethemethodisbothgentleandselective.Itisnothingmorethanaddingtoacellsuspensionenzymeswhichreactquicklywiththecellwallsanddestroythem.Becausetheenzymesselectivelycatalyzethesecellwallreactions,theyreactonlysparinglywithothersoluteswithinthecell（酶消化法的缺點在于酶的消耗限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用，雖然條件溫和、具有選擇性。細胞懸浮液中加入酶能迅速和細胞壁反應并破壞它們。酶選擇性的催化細胞壁反應，不破壞細胞內(nèi)的其它物質。）增溶：利用表面活性劑的增溶作用，將體積為細胞體積2倍的某濃度的表面活性劑溶液加入到細胞中去，表面活性劑能將細胞破碎，制成的懸浮液可通過離心分離除去細胞碎片Thesecondmajormethodofchemicallyrupturingcellsissolubilizationbydetergents.Typically,aconcentrateddetergentsolutionisaddedtoabouthalfthesolution’svolumeofcells.Thedetergentdisruptsthecellmem-brane.Theresultingsuspensioncanbecentrifugedtoremovecellfrag-ments,andthenrunthroughanadsorptioncolumnoranextractortoisolatetheproduct.(最典型的是將體積為細胞體積兩倍的某濃度的表面活性劑加入到細胞中。表面活性劑能將細胞壁破碎，制成的懸浮液可用離心分離除去細胞碎片，再用吸附柱或萃取劑分離制得產(chǎn)品。)脂溶：在細胞懸浮液中加入一定量的有機溶劑，細胞壁脂質層吸收后，導致胞壁膨脹，最后裂開，細胞質中的物質就釋放到周圍溶液中了堿處理：Alkalitreatmentistheantithesisofenzymedigestion,foritisharshratherthangentle,nonselectiveratherthanspecific,andcheapratherthanexpensive.Alkaliaddedtoacellsuspensionreactswiththecellwallsinanumberofways,includingthesaponificationoflipidsinthecellwalls.(堿處理法和酶消化法相反，反應激烈，不具選擇性，而且較便宜。堿加入細胞懸浮液中后和細胞壁進行了多種反應，包括使磷脂皂化。)2、械法勻漿法研磨法超聲波法：利用頻率高、波長短的超聲波進行細胞破碎，效率更高球磨破碎法3、其它破碎方法凍結－融化法（亦稱凍融法）干燥法四、本章作業(yè)1、簡述細胞破碎的意義2、細胞破碎方法的大致分類3、滲透壓的計算方法第五講萃取6學時一、通過本章學習因掌握以下內(nèi)容：1、什么是萃取過程？2、萃取平衡的條件？3、液－液萃取的分類？4、常見物理萃取體系由那些構成要素？5、何謂萃取的分配系數(shù)？其影響因素有哪些？6、掌握多級萃取萃取級數(shù)的計算方法。7、萃取設備的選擇方法8、何謂超臨界流體萃取？其特點有哪些？9、何謂雙水相萃取?常見的雙水相構成體系有哪些？10、反膠團的構成以及反膠團萃取的基本原理11、反應萃取的基本原理二、萃取過程利用在兩個互不相溶的液相中各種組分（包括目的產(chǎn)物）溶解度的不同，從而達到分離的目的物理萃取、化學萃取三、物理萃取利用溶劑對需分離組分有較高的溶解能力，分離過程純屬物理過程溶質：被萃取的物質原溶劑：原先溶解溶質的溶劑萃取劑：加入的第三組分萃取劑選擇原則：使溶質在萃取相中有最大的溶解度1、分配系數(shù)：衡量萃取體系是否合理的重要參數(shù)X/Y2、萃取分離的基本方程由物化理論可知：萃取操作達到平衡時，溶質在輕相和重相中的化學勢相等。即由上式可知，分配系數(shù)的對數(shù)值與標準狀態(tài)下的化學勢的差值有關因此，要提高溶質的分配系數(shù)，必須提高標準狀態(tài)下，其在重相與輕相的化學勢之差?？梢圆扇〉姆椒ㄓ校海╝）改變?nèi)軇╞）改變?nèi)苜|的特性l生成有用離子對－－可溶于萃取劑的離子對將強酸弱堿鹽或強堿弱酸鹽生成弱酸弱堿鹽l通過改變原溶劑中的pH值，改變?nèi)苜|的解離3、單級萃?。菏购苜|的溶液（h）和萃取劑（L）解出混合，靜止后分成兩層。4、多級萃?。菏枪I(yè)生產(chǎn)最常用的萃取流程分離效率高產(chǎn)品回收率高溶劑用量少5、常用的萃取設備混合－沉降器旋轉圓筒萃取塔離心萃取器填充塔噴霧塔旋轉圓盤塔四、超臨界流體萃取（SupercriticalFluidExtraction，SFE）1、超臨界流體：當一種流體處于其臨界點的溫度和壓力之下，則稱之為超臨界流體。特點：（a）密度接近液體－－萃取能力強（b）粘度接近氣體－－傳質性能好2、超臨界流體萃取的基本思想利用超臨界流體的特殊性質，使其在超臨界狀態(tài)下，與待分離的物料接觸，萃取出目的產(chǎn)物，然后通過降壓或升溫的方法，使萃取物得到分離常用萃取劑：（1）極性萃取劑：乙醇、甲醇、水（難）（2）非極性萃取劑：二氧化碳（易）3、超臨界二氧化碳萃取臨界點：T：304.1P：73.8bar優(yōu)點：缺點：臨界條件溫和設備投資大產(chǎn)品分離簡單無毒、無害不燃無腐蝕性價格便宜超臨界CO2萃取流程圖超臨界流體的應用（1）咖啡因萃?。?）植物油：胚芽油、玉米油、γ亞麻酸（3）天然香料：杏仁油、檸檬油（4）啤酒花（5）尼古丁五、雙水相萃取（AqueousTwoPhase）1、概念：利用物質在不相溶的，兩水相間分配系數(shù)的差異進行萃取的方法2、可以構成雙水相的體系：（1）離子型高聚物－非離子型高聚物PEG－DEXTRAN（2）高聚物－相對低分子量化合物PEG－硫酸銨3、雙水相萃取的原理依據(jù)懸浮粒子與其周圍物質具有的復雜的相互作用：（a）氫鍵（b）電荷力（c）疏水作用（d）范德華力（e）構象效應4、雙水相系統(tǒng)中目標物分配系數(shù)的影響因素（1）成相高聚物濃度－－界面張力（2）成相高聚物的相對分子量一般來說，蛋白等高分子量物質易集中于低分子量相（3）電化學分配雙水相萃取時，蛋白質的分配系數(shù)受離子強度的影響很?。?）疏水反應（5）生物親和分配（6）溫度及其它因素5、雙水相萃取的優(yōu)點（1）平衡時間短、含水量高、截面張力小，特別適合于生物活性物質的分離純化（2）操作簡便（3）易于放大六、反膠束萃?。≧eversedMicellesExtraction）膠束是表面活性劑在非極性有機溶劑中形成的一種聚集體當表面活性劑濃度超過臨界微團濃度時，表面活性劑會在水溶液中形成聚集體微團和反微團1、微團：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”2、反微團：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”3、反微團的優(yōu)點（1）極性“水核”具有較強的溶解能力。（2）生物大分子由于具有較強的極性，可溶解于極性水核中，防止與外界有機溶劑接觸，減少變性作用。（3）由于“水核”的尺度效應，可以穩(wěn)定蛋白質的立體結構，增加其結構的剛性，提高其反應性能。因此，可作為酶固定化體系，用于水不溶性底物的生物催化4、構成反膠團的表面活性劑種類（1）陰離子表面活性劑AOT（2）陽離子表面活性劑季銨鹽七、化學萃取1、概念：利用可與被萃目標物發(fā)生反應的非極性物質作為萃取劑進行的反應2、絡合萃取分離有機酸（醋酸）季銨鹽叔胺3、絡合萃取體系構成萃取劑稀釋劑八、本章作業(yè)1、什么是萃取過程？2、液－液萃取從機理上分析可分為哪兩類？3、常見物理萃取體系由那些構成要素？4、何謂萃取的分配系數(shù)？其影響因素有哪些？5、何謂超臨界流體萃??？其特點有哪些？6、何謂雙水相萃取?常見的雙水相構成體系有哪些？7、反膠團的構成以及反膠團萃取的基本原理第六講吸附與離子交換6學時一、通過本章學習應掌握的問題1、什么是吸附過程？2、吸附的類型有哪些？它們是如何劃分的？3、常用的吸附劑種類有哪些？4、什么是吸附等溫線？其意義何在？5、影響吸附過程的因素有哪些？6、什么是親和吸附？其特點有哪些？7、常用的吸附單元操作有哪些方式？8、什么是離子交換？9、離子交換樹脂的分類？其主要的理化性質有哪些？10、離子交換的機理是什么？11、什么是離子交換的選擇性？其選擇性受哪些因素影響？12、基本的離子交換操作是怎樣的？13、如何利用離子交換法分離蛋白質？二、什么是吸附？（Adsorption）1、吸附是利用吸附劑對液體或氣體中某一組分具有選擇性吸附的能力，使其富集在吸附劑表面的過程。2、吸附過程通常包括：待分離料液與吸附劑混合、吸附質被吸附到吸附劑表面、料液流出、吸附質解吸回收等四個過程。三、常見的吸附類型及其主要特點1、物理吸附：吸附作用力為分子間引力、無選擇性、無需高活化能、吸附層可以是單層，也可以是多層、吸附和解吸附速度通常較快。2、化學吸附：吸附作用力為化學鍵合力，需要高活化能、只能以單分子層吸附，選擇性強、吸附和解吸附速度較慢。四、常用吸附劑種類吸附劑通常應具備以下特征：對被分離的物質具有較強的吸附能力、有較高的吸附選擇性、機械強度高、再生容易、性能穩(wěn)定、價格低廉。1、活性炭：是非極性吸附劑，因此在水中吸附能力大于有機溶劑中的吸附能力針對不同的物質，活性炭的吸附規(guī)律遵循以下規(guī)律：（1）對極性基團多的化合物的吸附力大于極性基團少的化合物（2）對芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物;（3）對相對分子量大的化合物的吸附力大于相對分子量小的化合物;（4）pH值的影響堿性中性吸附酸性洗脫;酸性中性吸附堿性洗脫;（5）溫度未平衡前隨溫度升高而增加;2、大孔網(wǎng)狀吸附劑特點：脫色去臭效果理想；對有機物具有良好的選擇性；物化性質穩(wěn)定；機械強度好；吸附速度快；解吸、再生容易。但價格昂貴，吸附效果易受流速以及溶質濃度等因素的影響。大孔網(wǎng)狀吸附樹脂的種類：（1）非極性吸附樹脂：苯乙烯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑為二乙烯苯，又稱芳香族吸附劑。（2）中等極性吸附樹脂：甲基丙烯酸酯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑亦為甲基丙烯酸酯，故又稱脂肪族吸附劑。（3）極性吸附劑：丙烯酰胺或亞砜經(jīng)聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基團。吸附機理：非離子型共聚物，借助于范德華力從溶液中吸附各種有機物，其吸附能力與樹脂的化學結構、物理性能以及與溶質、溶劑的性質有關。通常遵循以下規(guī)律：（1）非極性吸附劑可從極性溶劑中吸附非極性溶質；（2）極性吸附劑可從非極性溶劑中吸附極性物質；（3）中等極性吸附劑兼有以上兩種能力四、吸附等溫線概念：當溫度一定時，吸附量與濃度之間的函數(shù)關系稱為吸附等溫線。Langmuir吸附等溫線qo和K是經(jīng)驗常數(shù)，c代表溶液中溶質濃度蛋白質分離提純時適合此吸附方程五、影響吸附的主要因素1、吸附劑的性質：比表面積、粒度大小、極性…2、吸附質的性質：對表面張力的影響，溶解度，極性，相對分子量…3、溫度：吸附是放熱過程，吸附質的穩(wěn)定性4、溶液pH值：影響吸附質的解離5、鹽濃度：影響復雜，要視具體情況而定六、親和吸附1、親和吸附分離是利用溶質和吸附劑之間特殊的化學作用，從而實現(xiàn)分離。吸附劑由載體和配位體組成2、親和吸附的特點（a）效率高：利用親和吸附可以從粗提液中一次性分離得到高純度的活性物質。（b）分離精度高：可用于分離含量極低，結構相近的化合物（c）但通用性較差，洗脫條件苛刻3、影響親和吸附的因素（1）配基濃度配基濃度高有利；（2）空間位阻加入“手臂鏈”以降低空間位阻的影響；（3）配基與載體的結合位點就蛋白質等大分子作為配基時，與載體連接的鍵越少越好；（4）載體孔徑：孔道大小；（5）微環(huán)境：載體或“手臂鏈”的極性、電性；七、離子交換(ionexchange)1、概念：利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫侖力吸附在樹脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質從樹脂上洗脫下來，達到分離的目的。2、離子交換樹脂的構成（1）具有三維空間離體結構的網(wǎng)絡骨架（2）聯(lián)接在骨架上的活性基團（3）活性基團所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）3、離子交換的分類按活性基團分類，可分為陽離子交換樹脂(cationexchange)（含酸性基團）和陰離子交換樹脂(anionexchange)（含堿性基團）。具體又可以分為：強陽、弱陽和強陰、弱陰4、常用的離子交換樹脂（1）強酸性陽離子交換樹脂：活性基團是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；（2）弱酸性陽離子交換樹脂：活性基團有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基團；（3）強堿性陰離子交換樹脂：活性基團為季銨基團，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基；（4）弱堿性陰離子交換樹脂：活性基團為伯胺或仲胺，堿性較弱；5、新型離子交換樹脂（1）大孔離子交換樹脂大孔離子交換樹脂具有和大孔吸附劑相同的骨架結構，在大孔吸附劑合成后（加入致孔劑），再引入化學功能基團，便可得到大孔離子交換樹脂。（2）多糖基離子交換樹脂固相載體為多糖類物質，親水性強、交換空間大、對生物大分子物致變性作用主要的多糖基離子交換樹脂（a）離子交換纖維素樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團的性質可分為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類。特點：骨架松散、親水性強、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高常用的離子交換纖維素有：甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、二乙基氨基乙基纖維素（DEAE）（b）葡聚糖凝膠離子交換樹脂骨架為葡聚糖凝膠，如sepharose、sephadex，根據(jù)功能基團的不同，亦可分為陽離子交換和陰離子交換樹脂命名方法：交換活性基團+骨架+原骨架編號特點：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率常用的葡聚糖凝膠離子交換樹脂：CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-25等6、離子交換樹脂的理化性能（1）外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為16~60目>90%；（2）機械強度：>90%；（3）含水量：0.3~0.7g/g樹脂；（4）交換容量：重量交換容量、體積交換容量、工作交換容量或稱表觀交換容量（在某一條件下）；（5）穩(wěn)定性：化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性；（6）膨脹度：交聯(lián)度、活性基團的性質與數(shù)量、活性離子的性質、介質的性質和濃度、骨架結構；（7）濕真密度：單位體積濕樹脂的重量；（8）孔度、孔徑、比表面積7、離子交換機理8、影響交換速度的因素（1）顆粒大?。河≡娇欤?）交聯(lián)度：交聯(lián)度小，交換速度快（3）溫度：越高越快（4）離子化合價：化合價與高，交換越快（5）離子大小：越小越快（6）攪拌速度：在一定程度上，越大越快（7）溶液濃度：當交換速度為外擴散控制時，濃度越大，交換速度越快9、離子交換的選擇性離子交換常數(shù)：交換勢或交換系數(shù)10、影響離子交換選擇性的因素（1）水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；（2）離子化合價：高價離子易于被吸附；（3）溶液pH：影響交換基團和交換離子的解離程度，但不影響交換容量；（4）離子強度：越低越好；（5）有機溶劑：不利于吸附；（6）交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少；（7）樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；11、離子交換操作方法（1）樹脂預處理物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒；化學處理：轉型（氫型或鈉型）陽離子樹脂酸—堿—酸陰離子樹脂堿—酸—堿最后以去離子水或緩沖液平衡（2）離子交換吸附靜態(tài)：操作簡單、但是分批操作，交換不完全動態(tài)：離子交換柱，操作連續(xù)、交換完全，適宜多組份分離柱式固定床（3）洗脫離子交換完成后，將樹脂吸附的物質重新轉入溶液的方法洗脫方法（a）改變?nèi)芤簆H值（b）改變?nèi)芤弘x子強度（4）再生是指是離子交換樹脂重新具有交換能力的過程酸性陽離子樹脂酸-堿-酸-緩沖溶液淋洗堿性陰離子樹脂堿-酸-堿-緩沖溶液淋洗方式有：順流再生和逆流再生八、離子交換應用實例（離子交換法提取蛋白質）1、蛋白質的結構特點（1）多肽鏈（2）電荷分布不均勻（3）疏水性（4）不同的蛋白質具有不同的表面電荷分布2、pH值對蛋白質荷電情況的影響3、蛋白質的滴定曲線不同的蛋白質由于其氨基酸組成的差異，具有不同的等電點（pI），當溶液（環(huán)境）pH值低于其pI時，蛋白質帶正電荷，而當環(huán)境pH值高于其等電點時，蛋白質帶負電荷，且偏離等電點越多，其所帶電荷越多；4、緩沖液pH的選擇離子交換是依據(jù)不同蛋白質荷電性質以及大小差異進行分離的，因此緩沖液的選擇將直接影響蛋白質的荷電情況，對于分離的選擇性具有重要影響。5、離子交換分離蛋白質的基本步驟蛋白質的離子交換分離同樣要經(jīng)過：平衡、吸附、洗脫和再生四個階段，具體過程如下圖所示：九、本章作業(yè)1、P223第一題，第二題2、影響吸附的主要因素？3、親和吸附的原理和特點是什么？4、常用的離子交換樹脂類型有哪些？5、影響離子交換速度的因素有哪些？6、用于蛋白質提取分離的離子交換劑有哪些哪些特殊要求，主要有哪幾類？第七講色譜技術6學時一、通過本章學習應掌握的問題1、什么是色譜分離技術？2、色譜分離技術的分類？3、什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計算理論塔板數(shù)？4、什么是吸附色譜及其分類和基本原理？5、什么是分配色譜？6、離子交換色譜的分類及應用7、凝膠色譜的分離原理及分類8、離子交換及疏水作用層析的原理9、高效液相色譜的分離原理及應用？10、蛋白質分離的常用色譜方法有哪些？二、什么是色譜技術（Chromatography）概念：色譜技術是一組相關分離方法的總稱，色譜柱的一般結構含有固定相（多孔介質）和流動相，根據(jù)物質在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達到分離的目的。簡單的說，色譜技術是在特定的色譜柱當中，利用不同物質與固定相的親和力差異而實現(xiàn)分離的一組技術。其優(yōu)點是分辨率高，是生化產(chǎn)品純化、分析的重要手段，這一切均源于其特殊的分離模式，即塔板理論三、色譜分離方法的分類色譜分離方法很多，種類有四、五十種。但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機理分，有以下幾種：1、吸附色譜2、分配色譜3、離子交換色譜4、凝膠色譜四、色譜分離的基本概念1、分配系數(shù)：可由Langmuir方程得出Kd分配系數(shù)q、c溶質在固相和液相中的濃度2、保留時間（tR）和保留體積（VR）：反應樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學參數(shù)之一3、色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度反應不同時刻溶質在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關系理論塔板數(shù)的計算方法：N理論塔板數(shù)tR保留時間W1/2半峰寬Wb峰底寬度理論塔板高度：L柱長五、吸附色譜1、原理：利用溶質與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導力、定向力以及氫鍵)的差異而實現(xiàn)分離2、關鍵要素：吸附劑（固定相）和展開劑（流動相）的選擇3、吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團，如-OH和-NH24、常用的吸附劑：氧化鋁、硅膠、活性炭、纖維素、聚酰胺、硅藻土5、展開劑的選擇展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大因此，可以根據(jù)實驗結果調整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果展開劑選擇的原則：（1）對被分離組分應具有一定的解吸附能力，極性應比被分離物質的極性略?。?）展開劑應對被分離物質具有一定的溶解能力6、吸附色譜的操作程序（1）根據(jù)要分離組分的性質（包括極性、分子量、分子結構）選擇合適的固定相和流動相（2）吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進行裝柱、平衡、上樣，測定穿透樣品含量以調整操作參數(shù)（3）洗脫：采用有機溶劑洗滌、調節(jié)pH值以及體系離子強度，最大限度地回收目標產(chǎn)物六、分配色譜1、原理：利用溶質在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法2、構成要素：固定相、載體、流動相載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體載體種類：硅膠、硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相流動相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）*反相色譜固定相是非極性的流動相是極性的3、HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography）是一種典型的分配色譜，它是基于化合物在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)分離的，由于經(jīng)過了多次的吸附－解析－吸附的過程，其理論塔板數(shù)可高達數(shù)萬（分析性HPLC）4、反相液相色譜反相液相色譜分離多肽和蛋白質使基于蛋白質的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學性質和流動相的選擇應最大限度地滿足疏水的要求載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm）HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質C18適于分離核酸苯基流動相的選擇通常采用有機溶劑，乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃七、離子交換色譜1、概念：以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法2、常用的離子交換樹脂（1）葡聚糖凝膠型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25（2）纖維素系列離子交換劑DEAE-SephacelCellex系列（3）瓊脂糖系列離子交換劑Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑（4）Source系列離子交換劑特點：介質均勻、分辨率高、流速快、反壓低陽離子交換樹脂S系列陰離子交換樹脂Q系列（5）MonoBeads系列離子交換劑（Pharmacia）特點：介質為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點，但動態(tài)載量更大，壽命更長。同樣分為Q系列和P系列八、分子篩凝膠色譜（GelPenetrationChromatography,GPC）1、概念：在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離2、特點：操作簡便分離效果好，重復性高，回收率高分離條件溫和應用廣泛適用于生物大分子的初級分離，脫鹽分辨率低3、分子篩凝膠色譜原理不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進入凝膠網(wǎng)格結構的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過，保留時間短；而小分子恰恰相反，保留時間較長）而得以分離（如上圖所示）九、疏水作用層析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）1、原理：依據(jù)生物大分子疏水性差異實現(xiàn)分離由于不同蛋白質分子氨基酸組成差異，其疏水性也不盡相同，HIC技術是基于生物大分子的疏水性差異而實現(xiàn)分離的，該方法彌補了HPLC難以用于蛋白質等生物大分子的分離的不足。具體方法是：在高鹽環(huán)境下，蛋白質表面的疏水區(qū)域暴露，固定相表面修飾了一些疏水的基團，這樣蛋白質的疏水部分即可與固定相發(fā)生較強的疏水相互作用，從而被結合在固定相表面，而一旦降低流動相的鹽濃度即可實現(xiàn)蛋白質的洗脫（見下圖），方便易行，是蛋白質分離的常用手段之一。十、親和色譜（Affinitychromatography）所謂親和色譜就是將親和技術和色譜技術集成得到的一種高效分離手段，其原理與親和吸附基本類似，所不同的是經(jīng)過修飾的載體顆粒是填充在色譜柱中，以實現(xiàn)連續(xù)的色譜分離載體活化、配基連接、吸附、洗脫十一、蛋白質分離常用的色譜方法1、免疫親和層析屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強的吸附力，實現(xiàn)特殊蛋白質的分離免疫親和層析介質的獲得：（1）獲得抗體（2）抗體連接到載體上2、疏水層析在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團，如苯基，可以與蛋白質的某些疏水基團相互作用，從而實現(xiàn)多組分的分離。3、離子交換色譜是最常用的蛋白質分離手段操作要點：由于蛋白質是兩性電解質，在不同的pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定由于蛋白質的極性基團很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽或弱陰離子交換劑適當調節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質適當解離，通常采用的pH值靠近其等電點（不是等電點）緩沖溶液的離子強度不能過高，通常在10~20mmol層析方案的確定，需要視試驗情況作適當調整洗脫方式：pH梯度離子強度梯度十二、本章作業(yè)1、色譜方法共分幾類？常用的蛋白質分離方法有哪些？并簡述其原理2、何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計算？3、簡述高效反相液相色譜的工作原理？4、試分析HPLC和HIC技術的異同第八講沉析3學時一、通過本章學習應掌握的問題1、什么是沉析？2、沉析法純化蛋白質的優(yōu)點有哪些？3、沉析的一般操作步驟是什么？4、何謂鹽析？其原理是什么？5、鹽析操作時常用的鹽是什么？6、影響鹽析的主要因素有哪些？7、有機溶劑沉析法的原理是什么？8、影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些？9、等電點沉析的工作原理是什么？10、其它常用的沉析方法有哪些？二、何謂沉析？（Precipitation）利用沉析劑（precipitator）使所需提取的生化物質或雜質在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。三、沉析的特點操作簡單、經(jīng)濟、濃縮倍數(shù)高，但針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強四、分類鹽析、有機溶劑沉析、等電點沉析等五、沉析操作的一般過程1、在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑；2、沉淀物的陳化，促進晶體生長；3、離心或過濾，收集沉淀物；六、鹽析(Saltinducedprecipitation)1、概念：在